Molekulaarbioloogia aruanne (0)

Bioloogia - Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

1 Hindamata

Tallinna Tehnikaülikool
Matemaatika -loodusteaduskond
Geenitehnoloogia Instituut
Molekulaar - ja rakubioloogia praktikum
YTM0012
MOLEKULAARBIOLOOGIA PRAKTIKUM
Pipeteerimine
Automaatpipetiga pipeteerimise põhitõed

Pipeteerimisel on kõige olulisem võtta õige suurusega pipett
Pipeteeritav vedelik peab olema homogeenne . Seintelt ja korgi küljest tuleks tilgad ja kondensaat põhja fuugida
Enne pipeteeritavasse lahusesse viimist vajuta kolb esimese astmeni alla. Pipeti tühjenemiseks on vaja vajutada kolb teise astmeni.

Viskoosse lahuse pipeteerimine
Vajalikud materjalid: pesuvahendi kontsentraat , vesi, pipetid koos otsikutega, falcon tuub , aukudega plaadike
Töö käik:

Kasutades 1 ml pipetti tegin 15-ml falconisse 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust (1,65 ml peduvahendit ja 3,85 ml vett)

Pipeteerisin kahte eppendorfi 1,55 ml lahust (mõlemasse)

Pipeteerisin alles jäänud lahus 200 μl kaupa plaadi aukudesse. Lahust jätkus 10 augu jaoks.
Järeldus: lahust pidi jätkuma 12 augu jaoks, kuna pärast eppendorfi pipeteerimist jäi 5,5 – 2 ∙ 1,55 = 2,4 ml lahust. Ja kui pipeteerida 200 μl (0,2 ml) kaupa, pidi olema täidetud 2,4/0,2 = 12 augu. Viga võiks tulla ebatäpsest esialgse lahuse pipeteerimisest ja kindlasti sellest, et detergendi lahus kipub vahutama, seda ei saa pipetti siis enam päris õiget mahtu.
Silmamõõt
Vajalikud materjalid: erinevate veekogustega eppendorfide rida (strip) – 8 tk
Töö käik:

Hindasin silmaga mitu μl vett igas tuubis
Minu tulemused:

200 μl (korras)

60 μl (korras)

100 μl (korras)

30 μl (tegelikult 10 μl)

20 μl (tegelikult 5 μl)

75 μl (korras)

50 μl (tegelikult 35 μl)

125 μl (tegelikult 150 μl)

Täpsuspipeteerimine

Vajalikud materjalid: broomfenoolsinine, äädikhappelahus, blotipaber, pipetid, 200-μl aukudega plaat

Töö käik:

Pipeteerisin plaadi viide auku 100 μl broomfenoolsinist

Pipeteerisin lisaks 50 μl, 5 μl, 1 μl ja 0,25 μl äädikhapet. Segasin. Lahuste värv muutus sõltuvalt äädikhape mahust.

Kasutades kõige väiksemat pipetti pipeteerisin blotipaberile oma nimi ja muster.

Järeldus: täpid on erineva raadiusega (suurusega), kuna pipeteeritud lahuste maht oli erinev, sõltuvalt mustrist. Aga täpid, mis olid sama vedeliku mahuga pipeteeritud, ei olnud alati sama suure läbimõõduga, sest ikka olid väiksed vead pipeteerimisel.

Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCRi) teostamine

PCRi kasutatakse valitud DNA lõigu paljunadamiseks. Väga tähtis moment reaktsiooni teostamisel on õigete praimerite valimine ning reaktsioonitingimuste kindel täitmine. PCR reaktsioon toimub kolme-etapiliselt: DNA ahelate denatureerimine, praimerite seondumine DNA ahelatega ning DNA süntees.

Oma töös kasutasin Reverse (vastassuunilise) praimerina SV-40 poly A, Forward (pärisuunalise) praimerina EGFP-3-170, ning plasmiidina pEGFP-FoxO3a-wt. Oodatav produkti pikkus – 2400 aluspaari .

Töö käik:

Pipeteerisin kokku PCRi reaktsioonisegu (20μl):

11,3 μl vett
2 μl 10x polümeraasi puhvrit – tagab vajalikud reaktsioonitingimused, nagu pH, soolade kontsentratsioon jt
μl 25 mM MgCl2 (lõppkonts. 2,5 mM) – Mg2+ ioonid on vajalikud polümeraasi töötamiseks
2,4 μl 2 mM dNTP (lõppkonts. 240 μM) – sisaldab 4 liiki nukleotiide
1 μl 10 μM Reverse ja 1 μl 10 μM Forward praimerit (lõppkonts. 0,5 μM) – komplimentaarsed vastassuunaliste ahelate otsadele
0,2 μl 25 ng/μl template-DNAd (lõppkonts. 0,25 ng/μl) – sisaldab DNA osa, mida on vaja paljundama
0,1 μl 5 U/μl HotFIRE Pol Polümeraasi (lõppkonts. 0,5 U/μl) – katalüüsib PCRi, peab säilitama oma aktiivsust kõrgel temperatuuril. Taq polümeraasid ei oma proof -reading aktiivsust (3’ – 5’ exonukleaasset aktiivsust), seega neil puudub võime kord valesti lülitatud nukleotiidi õigega asendada . See on tähtis TA-kloneerimisel, kuna meil on vaja, et moodustaksid sobivad restriktsioonisaidid edasiseks kloneerimiseks, kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine .

Segasin kõik vortexiga, fuugisin ning asetasin segu PCRi masinasse.

PCRi programmi kirjutamine:

95 °C 15 minutit – polümeraasi aktiveerimine

95 °C 10 sekundit – DNA ahelate denatureerimine

56 °C 20 sekundit – praimerite seondumine DNAle (annealing)

72 °C 3 minutit – DNA süntees

Kordamine alates 2. punktist 21 korda

Selline sünteesiaeg valitakse sõltuvalt polümeraasist. HotFIRE Pol sünteesib keskmiselt 1 kb DNAd 1 minuti jooksul ning selline aeg valitakse nii, et kõik järjestused jõudsid paljuneda ( näiteks meil oli kõige pikem produkt – 2400 aluspaari).

DNA lahutamine agaroosgeelis

Eesmärgiks on visualiseerida oma produkti ning hinnata selle suurust. DNA lahutamisel kasutatakse agaroosi (disahhariid, koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist).

päev: kasutatava agaroosgeeli kangust arvutatakse võttes arvesse oodatava produkti pikkust. Meie kasutasime 1% geeli. Segasime kokku 100 ml TAE puhvrit, 1 gr agaroosi ning kuumutasime mikholaineahjus sulamiseni. Jahtunud geelisegule lisasime1 μl EtBr, mida kasutatakse DNA visualiseerimiseks. Valasime lahus geelialusele ning jätsime tarduma järgmise praktikumini.

päev: lisasin PCR segule 4 μl 6x DNA värvi, et DNA nähtav oleks, ning kandsin kogu segu TAE geelile (hambasse). DNA lahutamine toimub elektrivoolu toimel (100 V 15 min)

Kuna minu produkt ei ole üldse geelipildil nähtav, võin järeldada, et midagi tegin valesti PCR reaktsiooni teostamisel (nt. viga pipeteerimisel või mingi muu viga). Sain geelitükki teiste plasmiidi ja praimeritega.

Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari.

PCR produkti puhastamine geelist Zymoclean kitiga.

Eesmärgiks on puhastada välja PCRi segust meid huvitav produkt, et vältida praimerite, nukleotiidide või erinevate soolade mõju järgmisele etapile.

Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari.

Puhastamine:

Saadud geelitükk kaalus 0,04 g. Lisasin 120 μl ADB-d (0,3 ml 0,1 g geeli kohta)

Inkubeerisin 37 °C juures 5 minutit, et geelitükk oleks täielikult sulanud

Pipeteerisin segu kolonni, mis on omakorda kogumistopsis. Tsentrifuugimine – 30 sek, et kogu lahus jookseks läbi kolonni. Visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära.

Pipeteerisin peale 200 μl pesupuhvrit. Fuugimine – 30 sek, visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära (seda etapi tuleb korrata 2 korda)

Järgmisena pipeteerisin kolonni keskele 10 μl MQ vett (elueerimiseks). Vett saab kasuta ainult juhul, kui selle pH > 6,0.

Jälle fuugimine 1 minuti jooksul – praimerite, nukleotiidide ja erinevate soolade eraldamine. Epsis on elueerinud PCRi produkt, mis on valmis edasiseks ligeerimiseks.

Kontrollgeeli pilt. Oodatav produkti pikkus – 700 aluspaari, pildil on näha, et umbes nii see ongi.

Rekombinantse plasmiidi ligeerimine

Eesmärgiks on meie DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk tervikliku plasmiidi taasloomine. Väga tähtis segada vektor ja sisestav DNA omavahel sobivates kontsentratsioonides, iga molekuli vektori jaoks peaks olema segus kolm sisestava DNA molekuli. DNAde otsad seovad komplementaarselt kokku ligaasi abil.

Me kasutasime kloneerimiseks pSTBlue-1 vektorit (T-overhangidega), kuhu saab sisestada saadud DNA järjestuse (A-overhangidega inserdi 3’ otsades). Toimub A-T otste komplementaarne paardumine ning vektor ja DNA ligeeritakse.

pSTBlue-1 vektor sisaldab replikatsiooni vajaliku origini, antibiootikumiresistentsuse geeni ning ka lacZ operooni, mis annab bakterile lisatoitumisallika, kuna kodeerib β-galaktosidaasi. β-galaktosidaas lõhub β1-4 glükosiidsidet ja erinevaid substraate ette söötes saame kindlaks teha, millised meie kasutatud bakterikoloonuatest sisaldavad tühja plasmiidi ja millistel on insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“.

Ligeerimiseks tuleb pipeteerida kokku ligeerimissegu (5 μl), segada pipeti või vorteksi abil, vajadusel fuugida ning jäta ligeerimiseks järgmise päevani +4 °C juures. Ligeerimissegu:

1 μl puhastatud PCRi produkti
1 μl pSTBlue-1 vektorit (9 ng/μl)
0,5 μl 10x puhvrit
1 μl T4 DNA ligaasi (sünteesib fosfodiester sidemeid)
1,5 μl MQ vett

Transformeerimine

Eesmärgiks on peale ligeerimist saadud DNA molekuli viimine kompetentsetesse E. Coli bakterisse ja see on oluline selleks, et saaksime kiiresti ja odavalt ning väga väikese vigade hulgaga palju seda plasmiidi (paljundame seda bakteris). Bakterid on eelnevalt töödeldud divalentsete katioonidega (Ca2+, Mn2+), mis muudab rakuseina laengu positiivseks . Plasmiidse DNA lisamisel kinnitub see rakuseinale. Bakteri rakke kuumutatakse lühikest aega ning kuna E. Coli rakke töödeldakse külmades tingimustes, toimub temperatuuri muutus ( heat shock) ning selle tulemusena tekivad rakuseina kahjustused, kust plasmiidne DNA pääseb rakku.

Sini-valge selektsioon : järjestus on kodeeritud lacZ keskele ning lacZ kodeerib β-galaktosidaasi. Substraadi X-gal juuresolekul tekitavad bakterid elutegevuse käigus (β-galaktosidaas hüdrolüüsib glükosiidsideme ja tekivad galaktoos, mille bakter ära sööb, ning 5-bromo-4-kloro-3-hüdroksüindool, mis dimeriseerumise ja oksüdeerimise tagajärjel annab sinist värvi) sinist pigmenti – kolooniad on sinised. Valgete kolooniade puhul sisestatav järjestus rikub lacZ geeni ning muudab sealt kodeeritava ensüümi inaktiivseks, mille tõttu sisestatud DNA järjestusega plasmiide sisaldavad bakterikolooniad ei värvu siniseks. Meid aga huvitavad valged kolooniad.

Transformeerimiseks on vaja inaktiveerida ligaas . Seda tegin eppendorfis, inkubeerides 5 min 70 °C juures.

Kompetentseid rakke tuleb võtta jääle sulama ning 10 min pärast lisasin 20 μl rakke ligatsioonisegule. Kogu segu inkubeerisin 30 min jääl. Meie kasutasime DH5α, mille kompetentsus on 107 (see tähendab, et 1 ng-ga transformeeritud tass annab 107 kolooniat)

Selle aja jooksul valatakse LB + Amp + X-gal + IPTG tassid: jälle sulatatakse agarsöödet (200 ml) ning pärast 50 °C-ni jahtumist lisatakse 200 μl X-gal, 200 μl ampitsiliini ning 25 μl IPTG-d. Pärast segamist valasin homogeenne sööde õhukese kihina Peetri tassile, kus ta jäi mõneks ajaks tarduma.

IPTG-d on lac promootorit aktiveeriv reagent , X-gali on vaja, et bakterite elutegevuse käigus söötmes oli näha sinist pigmenti, antibiootikumi lisatakse, et oleks võimalik selekteerida välja bakterid, kuhu on sisse läinud plasmiid (edukalt transformeeritud elusad bakterid vastava antibiootikumi juuresolekul)

Pärast inkubeerisin transformatsioonisegu 90 sekundit 42 °C juures (heat shock) ning tõstsin tuubi 2 minutiks jääle (jahutamine)

Lisasin 500 μl LB vedelsöödet ning inkubeerisin kõik 30 minutit 37 °C juures termostaadis.

Fuugisin bakterid põhja 2 minutit. Tekkis sade rakkudest, mille pealt tuleb sööde ära valada. Tuubi jäi umbes 100 μl.

Pipeti abil kandsin bakterid Peetri tassile ( tardunud söötmele) ning kuulikeste abil loksutasin bakterid ühtlaselt laiali. Asetasin tassid inkubaatorisse üleöö kasvama. Pärast säilitakse neid +4 °C juures järgmise nädalani. Minu Peetri tassil kasvasid üles umbes 3 valget kolooniat. Bakterikoloonia on üks bakter ja suur arv tema koopiaid.

Enne järgmist praktikumi tuleb panna saadud valged kolooniad kasvama. Selleks kasutasin eppendorfi, mille korgi sisse torkasin õhuaugu. Valasin 1 ml vedelsöödet (840 μl LB söödet), mis sisaldab 160 μl Amp-i (algne konts. 100 mg/ml) ning pipeti otsiku abil lisasin baktereid minu kolooniast (ühest, tähistasin seda Peetri tassil). Asetasin tuubid kasvama 37 °C inkubaatorisse.

Minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil

Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine. Selleks kasutatakse erinevaid lahuseid, mis muutuvad pH-d ja mille lisamise tagajärjel paljud fragmendid, mis saastavad plasmiidse DNA, tekitavad sadet ning neid on lihtne eraldada.

Aluselise lüüsi meetodil on tähtis see, et pH muutmisel bakteri genoomne DNA denatureerub kuid plasmiidse DNA ahelad jäävad seotuna teineteisega. Kui muuta pH esialgseks väärtuseks, siis bakterite genoomsed DNA molekulid agrigeeruvad ja tekitavad sadet soolade mõju tagajärjel ja plasmiidsed DNAd renatureeruvad tagasi. Nüüd fuugimisel lihtne genoomset DNAd eraldada plasmiidsest.

Võtsin kasvanud epsis bakterikultuur, fuugisin bakterid põhja 2 min maksimumpööretel ning eemaldasin pipetiga sööde sademe kohal.

Esimesena lisasin 0,2 ml E1 lahust ( Glükoos teeb lahust isotooniliseks, EDTA seob katioone samas inhibeerib paljusid ensüüme, Tris-HCl on puhverdav reagent ning Rnaas A eemaldab bakteraalse RNA prepsist)

Teisena lisasin 0,2 ml E2 lahust (SDS lahustab bakteriraku mambraani fosfolipiidid ja denatureerib valgud , NaOH denatureerib DNA struktuurid )

Lahus muutus „tatiseks“. Pärast 5 min inkubeerimist laua peal lahus muutus selgemaks.

Nüüd pipeteerisin peale 0,2 ml E3 lahust (KAc peatab lüüsi ning normaliseerib pH, mille tagajärjel valgud ja gDNA välja sadenevad)

Lahuses ilmusid valged helbed, mida tuleb fuugida 10 min maksimumpööretel.

Tõstsin supernatanti uude epsi ning lisasin 0,42 ml (0,7 mahtu) isopropanooli. Jälle fuugimine 10 min jooksul.

Tuubid peab panema fuugi nii, et see väike korgi osa (ei tea kuidas seda eesti keeles seletada) vaatas meie poole, sest fuugimisel sade tekib just sellisel tuubi põhja poolel. Tekib pisike plasmiidse DNA sade, mille pealt eemaldasin supernatanti.

Pipeteerisin sademele 200 μl 70% EtOH, fuugisin 5 min jooksul, et vabaneda sooladest, ning eemaldasin jälle sademe pealt etanooli.

Asetasin sadet kuivatada, et vabaneda etanooli jääkidest. Pärast suspendeerisin 20 μl MQ-s.

Nüüd DNA on puhas kontrolliks.

Kontroll-restriktsioon

Eesmärgiks on kontrollida kas soovitud DNA järjestus on sisestunud vektorisse nii nagu plaanitud oli. Restriktsiooni analüüsi käigus lõigatakse saadud DNA-d restriktaasiga ja vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi , et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida.

Kontroll-restriktsiooni teostamiseks esmalt pipeteerisin kokku 5,5 μl vett, 3 μl puhastatud DNA-d, 1 μl restriktaasi 10x puhvrit, 0,5 μl EcoRI restriktaasi, fuugisin ja inkubeerisin 37 °C 30 min jooksul

Kui 30 min on täis, fuugisin uuesti, kuna sooendamisel kaanele kondenseerus veeaur. Lisasin 2 μl 6x DNA värvi

Elektroforeesiks valasime 100 ml TAE geeli (1%)

Pipeteerisin kogu oma segu agaroosgeeli hambasse.

Tehtud pildist oli arusaadav, et ma ei saanud õige kõrgusega bändi. Nagu selgus, viga oli bakterite kasvamisel ja meil kasvanud bakterite kolooniad polnud tegelikult õiged. Võib olla põhjus selles, et ampitsiliin polnud nii effektiivne ja selektiivne. Need bakterid võiksid sattuda meie tassidele õhust, kuna selles praksiruumis tehakse töid paljude teiste preparaatidega.

Sekveneerimise tulemuste analüüs

Tavaliselt kontrollitakse saadud plasmiidi kasutades Sangeri meetodit. See meetod põhineb PCR reaktsioonil kuhu on lisaks tavaliste nukleotiidalustele lisatud ka selliseid aluseid, mis om märgitud fluorokroomiga ja mille nukleotiidi ahelasse lülitamise järel DNA pol antud ahela pikendamise lõpetab. Kuna iga terminaalne ddNTP on märgitud erineva fluorokroomiga saab DNA järjestuse teada lahutades saadud reaktsiooni kapillaarelektroforeesil ja lugedes saadud kromatogrammilt flourestsents märgiste järgi meid huvitava DNA järjestuse.

Mina valisin analüüsiks 7-hRin-T7-G01, kuna minu järjestust ei olnud nimekirjas.

Antud sekventsis on ainult kaks kohta, kuhu tekkisid punkmutatsioonid. Tegemist on transversiooniga, kuna puriin asendatakse purimidiiniga (G ja T asendus). Mutatsioonid võivad tekkida DNA molekuli sünteesi käigus.

Meie insert läks pST- Blue vektori õieti sisse ( mitte vastupidi, kuid see variant ka võis olla)

AATCTGAATTCGTAAGCTCGGTACCACGCATGCTGCAGACGCGTTACGTATCGGATCCAGAATTCGTGATTCTCGAGTCATGTCATATTTTCTCTCTTCTTCTTCAAAGAACCTTTGAGCTTCTTCCACAGGCTGTCTTTTCTCTTCAGTTTCTTTTCCATCAAGGATGGCATGGACTCCTTCTTGCGAATTTCCCTCACTAAGCCATGAAAAGCATCATCAATACAGAATCTGAGGGCTGCAGAGGTCTCAAAAAAACCACAATTATATTCTTGGGCAAGACTCAAGCCTTCTTCTGTAGAAACCTGGCGGAACTGTTCCAGATCAATTTTGTTACCCACCAGCACCAGGGGAATTTCATAGGTGTGGCGGACCTGAAAAATGAGCTCTTTAAACTTGGCAGCCTCCTGAAATGATTGACGGTCAGTGACGGAGTAGCAGATGATGAAGCCTTCCCCACCTCGCATGTACTGCTCCCGCATGGCTGTGAATTCTGCCTGGCCATCAGTGTCCAAGATGTCCAAGTAAGCTGGCTCATTGTCAATCCTGACCTGGGTCTTATAAGCATCTTCTATAGTAGGGTCATGATAATCAGGGAACTGATGACTAATAAACTGCATTGTCATTGCGCTTTTACCAACTCCCCCTGCTCCCAGCATTACCACCTTGTACTCTCTGGACCCGCCTGATGCGCTGCCCGGGGAGCAGCTGGCTTCATTTTCTACCTCGGATCC

Plasmiidse DNA edasine kasutus

Olenevalt sellest, millisteks katseteks uuritavat järjestust vaja on, toimub edasine kloneerimine . Kui tegu on valku kodeeriva DNA järjestusega, mida soovitakse ekspresseerida mõnes eukarüootses rakus või rakuliinis, siis tõstetakse lihtsasse bakteriaalsesse kloneerimisvektorisse sisestatud järjestus edasi mõnda ekspressiooni vektorisse. Selline vektor sisaldab vajalikke järjestusi valgu ekspressiooniks rakkudes, aga ka bakteris paljundamist võimaldavaid elemente, kuid millesse kloneerimine otse PCR-ist oleks liiga tülikas. Seega restrikteeritakse esialgsest bakteriaalsest vektorist soovitud järjestus uuesti välja ja ligeeritakse samade restriktaasidega lõigatud ekspressioonivektori MCS-i. Uut konstrukti paljundatakse jällegi algul bakterites ja puhastatakse välja suurem kogus DNA-d.

RAKUBIOLOOGIA PRAKTIKUM

Rakkude sulatamine ja paljundamine

Eesmärgiks on tutvustada loomarakkude kasvatamise aluseid, vajalikku aparatuuri, materjale ja põhilisi töövõtteid. Tutvustada loomarakkude külmutamise, säilitamise ja sulatamise põhialuseid.

Loomarakke säilitatakse pikaajaliselt vedelas lämmastikus, lühemat aega säilivad ka -80 °C juures. Rakkud on vaja külmutada selleks, et nad säiliksid korduskatsete jaoks (kuna aja jooksul r. omadused muutuvad) või asendamiseks, kui nas saastuvad.

Loomarakud on suhteliselt õrnad ja satuvad kergesti stressi. Nendega kokkupuutuvad lahused peavad olema reeglina eelsoojendatud vähemalt toatemperatuurini.

Esimene päev – rakkude kasvatamine

Söötme valmistamiseks (50 ml) tuleb valada tuubi 44,5 ml DMEMi ja lisada 5 ml FBSi (veise loote seerum ). Seerum on hüübinud vere vedel osa. Ta sisaldab rakkude kasvuks ja paljunemiseks vajalikke faktoreid (nt. albumiine, kasvufaktoreid, vitamiine, rasvhappeid , lipiide jm). Lisada 0,5 ml 100x penitsiliini ja streptomütsiini ( PEST ) varulahust. Segada keerates ettevaatlikult topsi.

Soojendada sööde 37 °C vesivannis. Pipeteerida 15 ml tuubi 5 ml söödet ja 6 cm tassile 4 ml söödet.

Võtta külmast krüoviaaliga rakud (NIH3T3 – hiire embrüonaalsed fibroblastid ) ja sulatada kiirelt (tegin seda käes), kuna külmutussegi sisaldab DMSO-t, mis on soojana rakkudele toksiline .

Järgmisena võtta 15 ml tuubist automaatpipetiga 0,5 ml sooja söödet ja lisada viaali, tõsta rakud 15 ml tuubi ringi. Fuugida rakud põhja 5 min 1000 rpm toatemperatuuril (kuna rakud on õrnad, kiirus ei tohi olla üle 1000 rpmi).

Pärast fuugimist tuleb tõmmata vaakumpumbaga sööde rakkudelt, kasutades Pasteuri pipeti ning steriilset otsikut.

Tuubile rakkudega lisada 0,5 ml söödet (6 cm tassilt), suspendeerida ning panna tagasi tuubist tassile. Teha tassiga 8-kujulisi liigutusi, et rakud tassil ühtlaselt jaotuksid ning asetada oma tass CO2 inkubaatorisse.

Enamus rakuliine vajab kasvamiseks temparatuuri 37 °C ja pH-d vahemikus 7,2 – 7,4. Selliste tingimuste tagamiseks kasutatakse spetsiaalseid inkubaatorkappe, kus lisaks vajalikule temp. on ka kõrgem CO2 sisaldus (5%), mis võimaldab stabiilse pH säilitamise.

Teine päev – rakkude paljundamine

Esmalt tuleb rakkud vaadelda mikroskoobis, et hinnata nende tihedust ning seisukorda. Rakud ei ole saastanud ega surnud ning nende tihedus on umbes 20%.

Pesta rakke 1x PBSiga (PBS on sobiva pH-ga ja osmootset tasakaalu hoidev lahus). Selleks rakkudelt imeda vaakumiga sööde (tassi kallutades), pipeteerida 4 ml PBSi tassi külje vastu, et rakud lahti ei tuleks, loksutada õrnalt ning rakkudelt imeda vaakumiga PBS. PBSiga pestakse rakke selleks, et eemaldada surnud rakud, söötmejäägid ja seerum.

Lisada 0,2 ml trüpsiin -EDTA lahust, inkubeerida mitte rohkem kui 5 min. Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud ning aitab rakud plastiku küljest lahti saada. Kui liiga kaua inkubeerida hakkab ka raku teisi valke lõikama. Et pärast inhibeerida trüpsiini toimimist, lisatakse 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS + PEST). Suspendeerida rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti.

Tassile peab jääma rakkude tihedus 10%. Meie hinnatud rakkude tihedus on 20%. Seega tassile peab jääma 600 μl rakususpensiooni. Ülearustest rakkudest (600 μl) teeme edasi lüsaati ning selleks võtame neid pipetiga uue epsi.

Lisada 4 ml-ni söödet (seega 3,4 ml), teha 8-kujulisi liigutusi ning asetada tass CO2 inkubaatorisse.

Rakkudest lüsaadi valmistamine

Eesmärgiks on tutvustada erinevaid võimalusi rakkude lüüsimiseks valkude, RNA või DNA edasiseks analüüsiks.

Genoomse DNA eraldamine imetajarakkudest

Rakud lüüsitakse puhvris, mis sisaldab SDS-i (lahustab rakumembraanid), NaCl, EDTA-d (inhibeerib nukleaase) ja proteinaas K-d (lagundab valgud) pidevalt segades 37°C või 55°C juured. DNA sadestatakse isopropanooliga, mille tulemusena tekkib lahusesse DNA pundar, mille saab otsiku abil tõsta puhtasse tuubi. DNA lahustamiseks kasutatakse enamasti Tris-HCl puhvrit EDTA-ga.

DNAd saab edasi kasutada genotüüpiseerimiseks, mingite lõikude amplifitseerimiseks, kloneerimiseks jne.

RNA eraldamine imetajarakkudest

RNA eraldamiseks kasutatakse tänapäeval enamasti spetsiaalseid komplekte ehk kitte. Kasutatakse ka vedelat lämmastikku. RNA eraldamisel on väga oluline hoida puhtust, sest RNAaase on peaaegu igal pool ja RNA laguneb suhteliselt kergesti.

RNAd kasutatakse enamasti cDNA sünteesiks ja seda omakorda amplifitseeritakse, et määrata erinevate mRNA-de ekspressioonitasemeid rakkudes.

Valkude eraldamine imetajarakkudest

Valkude eraldamiseks lüüsitakse rakud pehmemates tingimustes kui DNA eraldamisel. Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti membraanide lahustamiseks (SDS, Triton X-100, NP-40), lisaks veel glütserooli , vajadusel EDTA-d või muid lisandeid. Lüüsipuhvri koostis sõltub sellest, milliseid valke täpselt uurida soovitakse.

Saadud valgulüsaati kasutatakse edasi n. immuunosadestamiseks, Western blotiks, ELISA analüüsiks.

Valmistada 15 ml tuubi 5 ml lüüsipuhvrit. Segada: 250 μl 1M Tris-HCl, 150 μl 5M NaCl, 0,5 ml 10% Triton-X 100, 1 ml 50% glütserooli, 20 μl 0,5M EDTA, 3,08 ml MQ-d. Panna puhver jääle.

Fuugida trüpsiniseerimisel üle jäänud rakud (3 min 1000 rpm). Eemaldada supernatant. Lisada 1 ml PBSi (et eemaldada söötmejäägid), loksutada õrnalt, fuugida uuesti, eemaldada supernatant.

Asetada rakud jääle, lisada 200 μl lüüsipuhvrit ja 4 μl 50x proteaaside inhibiitorite segu. Korralikult suspendeerida ning asetada epsid rakkudega 30 minutiks +4°C juurde.

Pärast fuugida 3 minutit, et lahusesse jäid valgud ja sadenesid membraanid ja nukleiinhapped. Teha oma proovidest uude epsi 2x lahjendus lüüsipuhvriga (selleks pipeteerisin 15 μl lüsaati ja 15 μl puhvrit kokku).

Mõõdame saadud lüsaatide kontsentratsioonid BSA kitiga.

BSA lahjendusterea ettevalmistamine

BSA standardlahuse kontsentratsioon on 2 mg/ml. Sellest tuleb teha 2x lahjenduste rida: 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0 mg/ml ehk puhas MQ.

Panna ritta kuus epsi, kirjutada peale vajalikud kontsetratsioonid (esimene on 2 mg/ml).

Pipeteerida igasse epsi 50 μl MQ.

Esimesse epsi lisada 100 μl alglahust (konts-ga 2 mg/ml).

Teisse epsi lisada esimesest epsist 50 μl. Suspendeerida korralikult 5 korda. Saadud lahuse kontsentratsioon – 1 mg/ml.

Järgmisesse epsi lisada teisest epsist (sama otsikuga) 50 μl lahust. Jälle suspendeerida 5 korda.

Korrata tegevust lõppuni. Viimasesse epsi konts-ga 0 mg/ml jääb puhas MQ.

BSA töölahuse ettevalmistamine

BSA töölahust kuulub 100 μl 96-augulse plaadi ühe augu kohta. Iga proovi peab panema kahte auku (lahjendamata ja 2x lahjendus), seega 4 welli paari peale. Kui meie rühmas oli 7 paari, siis on vaja lahust kokku 4 ∙ 7+6 = 34 welli jaoks.

100 μl ∙ 34 = 3400 μl + 10% = 3740 μl töölahust (palju tegelikkus oli, ma ei mäleta, kuna ise ei teinud sellist töölahust)

Segada 50 osa reagenti A ja 1 osa reagenti B kokku. Saadud lahus oli heleroheline.

Reaktsiooni kokkusegamine

Jagada A+B 100 μl kaupa aukudesse.

Pipeteerida esmalt lahjenduste reast kõiki proovi 5 μl, lisaks puhas lüüsilahus.

Pipeteerida oma proovi 5 μl (2 tk) ja selle 2x lahjendust 5 μl (2 tk).

Raputada plaadid segamiseks. Reaktsiooni tulemusena muutub lahuse värvus lillaks (mida rohkem valku, seda tumedam lilla).

Aurumise vältimiseks kaetakse plaat kaane või teibiga, inkubeeritakse 30 min 37°C juures, mõõdetakse neeldumist 562 nm juures ning saadud väärtuste järgi arvutatakse valgulüsaadi kontsentratsioon.

Transfektsioon

Eesmärgiks on tutvustada transfektsiooni meetodit uuritava valgu ekspresseerimiseks loomarakus.

Transfektsioon on võõr-DNA ( plasmiidid ) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku. Plasmiidi sisseviimiseks peavad rakud ennast hästi tundma ja paraja tihedusega olema (reeglina 50-70%).

Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat , katioonsed polümeerid , dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid ) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon).

Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab:

komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (originit ning antibiootikumi resistentsusgeeni)
kloneerimisala (MCS) – paljude erinevate restriktaaside lõikekohad
uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul)
reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust
eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust
selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti

pEGFP :

võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes
võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus
replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T-antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni

Esimene päev – rakkude transfekteerimine PEI-ga

Esmalt tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra. Rakud ei ole saastanud ega surnud. Rakkude tihedus on umbes 95%.

Transfektsioonisegu ettevalmistamine. Võta 3 1,5 ml epsi.

Esimeses segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFPd.
Teises segada 25 μl DMEMi ja 0,5 μl pEGFP/FoxO3a
Kolmandas segada 50 μl DMEMi ja 2 μl PEI lahust.

Jagada segu kolmandast epsist võrdselt DNA segudele (26 μl kaupa), segada läbi, fuugida ja inkubeerida 10-15 min toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja PEI kompleksid , lahus muutub häguseks.

Tõsta katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. Pipeteerida oma transfektsioonisegud klaasidele.

Rakkudelt imeda vaakumiga sööde, pesta 1 ml PBSiga, PBS ära imeda. Lisada 0,2 ml trüpsiin-EDTA lahust, inkubeerida mitte rohkem kui 5 min. Lisada 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS NB! antibiootikumideta, kuna koos teiste reagentidega võivad need muutuda rakkudele toksiliseks), suspendeerida rakud automaatpipetiga tassi küljest lahti.

Teha söötmega sobiv lahjendus, et rakkude lõpptihedus 24-augulisel plaadil oleks 30%. Meie rakkude algne tihedus oli 95%.

tiheduste suhe: 95/30 = 3,16x
pindalade suhe: 21/1,9 = 11,05x
lahjendus: 3,16 ∙ 11,05 = 34,92x
1200 μl / 34,92 x = 34,36 μl rakke

1 welli kohta võtame 500 μl, seega 2 welli kohta (+10%) 1100 μl rakususpensiooni.

1100 μl – 2,2 ∙ 34,36 μl = 1100 μl (kokku) – 75,59 μl (rakud) = 1024,41 μl (sööde)

Pipeteerida rakususpensioon klaasidel olevatele transfektsioonisegudele, loksutada. Asetada rakud CO2 inkubaatorisse. Söötme vahetus 2-4 h möödudes on vajalik ainult tudlike rakuliinide puhul.

Teine päev – mikroskoopia

Kahjuks, üks meie wellist (mis ei sisaldanud FoxO3a-d) oli saastanud ja suspensiooni värv muutus kollaseks ning lahus ise muutus hägusaks. Värvuse muutus tähendab keskkonna pH muutumine happelisemaks bakterite elutegevuste käigus.

Saastumine võis tekkida halvasti steriliseeritud vahendite tõttu või töötades laminaari all käed liiguksid liiga laminaari alt välja ning bakterid õhust sattusid meie proovidele.

Kui vaatlesime mikroskoobi all saastanud proovi, siis nägime mustaid „mulle“ rakkude vahel, neid oli üsna palju.

Kui vaatlesime mikroskoobi all puhast proovi, siis nägime oma rakke ka musta sodina (võrreldes bakteritega ), kuid nad on palju suurem ning lülitades valgust ära nagime neid roheliste täppidena (GFP signaali järgi).

Rakkude immuunotsütokeemiline värvimine

Eesmärgiks on tutvustada immuunotsütokeemia ja fluorestsentsmikroskoopia meetodeid rakkudes molekulide ja rakukomponentide asukoha uurimiseks.

Fluorestsents - aine omadus emiteerida valgust pärast ergastamist kindla lainepikkusega kiirgisega. Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis - ja emissioonispektrid.

Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid.

Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt
Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid.

Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, asmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist.

Esimene päev – rakkude fikseerimine

Valmistada vajalikud lahused:

Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10 ml (oli valmis)

0,4 g PFA puru + 1 ml 10x PBSi + 9 ml vett

1x PBS, 50 ml

5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ, segada

PBS- Tween : 1x PBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50 ml

5 ml 10x PBSi + 45 ml MQ + 50 μl Tween 20

Permeabiliseerimislahus: 50 mM NH4Cl , 0,5% Triton X-100 PBSis, 1 ml

50 μl 1M NH4Cl + 50 μl 10% Triton X-100 + 100 μl 10x PBSi + 800 μl MQ

Blokklahus: 2% BSA, 0,1% NaN3 PBSis, 2 ml (oli valmis)

0,04 g BSA-d + 20 μl 10% NaN3 + 1,98 ml MQ

Fikseerimine: rakkudelt eemaldada vaakumiga sööde, lisada 0,5 ml fikseerimislahust, inkubeerida 15 min ning pesta rakke ülearusest PFAst 3 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga.

Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust (lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks), inkubeerida 15 min ning pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga.

Blokeerimine: lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust, jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist.

Teine päev – immuunotsütokeemia

Inkubatsioon primaarse antikehaga . Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (200 μl): 20 μl 2% BSA lahust + 180 μl 1x PBSi + Mouse anti tubuliin 1:500 0,4 μl, segada. Lisada lahus rakkudele ja inkubeerida 60-90 min toatemperatuuril, mille jooksul primaarne antikeha seondub oma sihtmärgiga. Pärast pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga seondumata antikeha eemaldamiseks

Inkubatsioon sekundaarse antikehaga. Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (400 μl): 40 μl 2% BSA lahust + 360 μl 1x PBS-Tweeni + Goat anti mouse Alexa568 (punast värvi) 0,2 μl, segada. Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. Pesta 1 kord 1 ml MQga.

Alusklaasidele panemine ehk sulundamine.

Kirjutada alusklaasile oma nimi, kuupäev ja kasutatud antikeha.
Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt .
Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit.
Asetada katteklaas (rakud allpool!) sulundamislahuse tilga sisse (vältida mulle)
Lasta kuivada ja säilitada pimedas

Kolmas päev – fluorestsentsmikroskoopia

Fluorestsentsmikroskoobi tööpõhimõte: ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla lainepikkusega valgust, mis on sobiv fluorokroomi ergastamiseks. Emiteeritud valgus sorteeritakse palju tugevamast ergastavast valgusest teise filtri abil.

Oma rakkude vaatlemiseks kasutame 60x õliobjektiivi, mille kasutades tuleb esmalt katteklaasile lisada tilk immersiooniõli.

Vaatlesime rakke rohelises, punases ja sinises kanaalis.

pilt: pEGFP/FoxO3a-ga transfekteerunud rakud. Roheline – FoxO3 liitvalk, mis asub tsütoplasmas. On näha ka tuumad.

pilt: Mouse anti tubuliin ja goat anti Mouse Alexa568-ga värvitud rakud. On näha mikrotuubuleid. Punane – sekundaarse antikeha küljes olev fluorokroom Alexa568. Number 568 näitab lainepikkust nmeetrites (absorb 578 nm ja emit 603 nm)

pilt: Tripleband filtriga tehtud pilt. Sinine – fluorestseeruv värv DAPI, mis värvib DNAd. On näha tuumad. Neeldumismaximum 461 nm juures.

FoxO3a ise kuulub transkriptsioonifaktorite perekonda. Sellise valgu funktsioonideks on apoptoosi reguleerimine ning kaitsmine oksüdatiivsest stressist reguleerides antioksüdante.

.DOCX Laadi alla originaalfail 18 lk · .docx · 81 allalaadimist

100 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 100 punkti.

~ 18 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2016-04-11 Kuupäev, millal dokument üles laeti

81 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

lllKsenia Õppematerjali autor

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikumi aruanne

bakter plasmiid rakud fuugi sööde vektor reaktsioon antikeha

Sarnased õppematerjalid

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia

Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne YAGB41 Kevad 2014 Vlada Šiposa Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne 1. Praktikum – pipepteerimine. Töötasime erineva suuruse pipettiga: 1000, 200, 20 ning 10 µl. Igale pipettile sobib oma suurusega otsik. Otsikud on steriilsed ja neid ei tohi neid näpuga katsuda. Pärast kasutamist tuleb otsikud ära visata spetsiaalsele konteinerisse. Otsik peab istuma tihkelt, kuna kui istub liiga lõdvelt, siis sissetõmbav kogus on tegelikult vähem, kui oodetud (tõmmatakse sisse ka õhk)

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaar- ja rakubioloogia

Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-Loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum Aruanne Koostanud: Luise Tiks YASB61 112332 Tallinn 2014 Pipeteerimine Harjutus 1 1 ml pipetti kasutades pipeteerisin 15-ml falconisse 1,65 ml detergenti, 3,85 ml vett (kokku 5,5 ml 30% lahust). Detergendi pipeteerimiseks kasutasin pahupidi tehnikat.

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaarbioloogia praktikumi protokoll

Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil. Saadud töö tulemused võivad leida kasutust molekulaargeneetika laboratooriumi teaduslikus uurimistöös. Käesolevas töös saab üliõpilane ettekujutuse genoomse DNA restriktsioonist, kloneermisest, raamatukogu-valmistamisest, PCR reaktsioonist, DNA sekveneerimisest, jt. molekulaarbioloogia põhilistest töömeetoditest. Iga üliõpilane esitab pärast töö teostamist protokolli (kas paberil või elektroonselt), milles toob ära põhilised tulemused ja lisaülesannete vastused. Kirjelduses märgib, millised etapid läbis edukalt ja millised olid probleemsed kohad. Töö nr 1: Inimese genoomse DNA restriktsioon Cfr42I restriktaasi abil. Saadud fragmentide ligeerimine "Bluescript" pBS SK+ plasmiidi ehk vektorisse. Lähteained:

Molekulaarbioloogia

docx

Molekulaarbioloogia protokoll

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum ARUANNE Ave Tüür 155356 YAGB41 Kevadsemester 2017 Tallinna Tehnikaülikool Pipeteerimine 8. veebruar I HARJUTUS Eesmärk: Õppida õigesti pipeteerima. Materjalid: Arvutused:  Pesuvahendi kontsentraat Pesuvahendit on vaja: 5,5 ×30

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

odt

Mikrobioloogia praktikumi vastused

0. teema 1. Miks ei saa mikroskoobi suurendust tõsta nähtava valguse lainepikkusega sarnase suuruse objektide jälgimisel? Valguse difraktsioon piirab. Valguskiirte paindumine väikeste esemete ümber tekitab difraktsiooniringid, mis ei võimalda väikesi ja lähestikku paiknevaid objekte eraldi näha. 2. Mis on mikroskoobi lahutusvõime? Vähim punktidevaheline kaugus d, mida on võimalik mikroskoobis eristada. 3. Mis on numbriline apertuur ja millest ta sõltub? korrutis n x sinα/2. Iseloomustab objektiivi läätse võimet valgust koondada. Sõltub objektiivi ja preparaadivahelise keskkonna murdumisnäitajast (n). 4. Kuidas on võimalik mikroskoobi lahutusvõimet tõsta? Suurendada NA-d ehk keskkonna murdumisnäitajat suurendada. Optiliselt tihedama keskkonna murdumisnäitaja on vedelikul suurem kui õhul. Kasutatakse immersiooniõli preparaadi ja objektiivi läätse vahele (optiliselt tihedam keskkond). 5. Kui suur on valgusmikroskoobi lahutusvõime piirväärtus? 0,2 mikrom

Mikrobioloogia

170

pdf

Meditsiinilise mikrobioloogia praktikum

Tartu Ülikool Mikrobioloogia instituut Meditsiinilise mikrobioloogia praktikum II osa Tatjana Brilene, Kai Truusalu, Tõnis Karki 2014/2015 1 Sisukord 1. Mikrobioloogilise diagnostika põhiskeem. Stafülokokknakkuste diagnostika. Streptokokknakkuste diagnostika..................................3 2. Enterobakterite nakkuste diagnostika uroinfektsioonide näitel............................................12 3. Enterobakterite nakkuste diagnostika sooleinfektsioonide näitel.........................................16 4. Bordetella ja Corynebacterium’i nakkuste diagnostika..........................................................21 5. Mycobacterium spp. infektsioonide diagnostika....................................................................26 6. Anaeroobsete infektsioonide mikrobioloogiline diagnostika.................................................32 7. Spiroheetid

Bioloogia

doc

Biotehnoloogia labori arvestuse küsimused ja vastused

B variant 1) Kirjeldage mikroorganismide külvamise tehnikaid. Millal on otstarbekas üht või teist kasutada? Joonkülvi kasutatakse põhiliselt tahketel agarsöötmetel kasvatatavate ja säilitatavate mikroorganismide kollektsioonide või töökultuuride uuendamiseks. Külvatakse enamasti katseklaasidesse valatud längagarile (kaldagarile), vahel ka Petri tassis olevale söötmele. Külvinõelaga kantakse kultuur agari pinnale (analoogiliselt joonkülviga kaldagarile) kas teatud sektorisse või üle kogu tassi pinna. Isoleeritud kolooniate saamiseks (N: puhaskultuuride eraldamisel) kasutatakse joonkülvi meetodi modifikatsiooni. Steriilse külviaasa või -nõelaga võetakse veidi külvimaterjali ja tõmmatakse sellega Petri tassi ühte serva mõned paralleeljooned (skeemil A). Külvinõel steriliseeritakse leegis ja läbi joonte A lõppude tõmmatakse ristjooned B. Külvinõel steriliseeritakse uuesti ja läbi joonte B tõmmatakse jooned C jne. Külvatava materjali k

Biotehnoloogia

Rohkem sarnaseid