Molekulaarbioloogia protokoll (0)

Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi:
Inimese genoomi CpG “saarekestel” paiknevate geenide kloneerimine
(genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon ,
rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine , bioinformaatiline analüüs)
Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands ). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin metüleeritakse (replikatsioonijärgselt aitab eristada värskelt sünteesitud DNA ahelat vanast ahelast ). Ekspresseeruvate geenide promootorpiirkondi ei metüleerita. Metüleeritud tsütosiin allub kergesti spontaansele desamineerimisele, tekib tümiin (reparatsiooniensüüm tümiin-DNA-glükosülaas eemaldab vigasest T/G paarist T väga väikese efektiivsusega) – seega jääb alles väga väike osa CpG järjestustest.
Seetõttu on CpG dinukleotiid evolutsiooniliselt säilunud ainult seal, kus tsütosiin ei ole metüleeritud, st ekspresseruvate geenide promootorpiirkondades.
TSÜTOSIIN 5-METÜÜLTSÜTOSIIN TÜMIIN
Selleks, et eraldada selliseid saari ülejäänud genoomi suuresti A-T rikastest piirkondadest oleks sobiv kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC’GG; NotI GC’GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile CmpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud).
Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil. Saadud töö tulemused võivad leida kasutust molekulaargeneetika laboratooriumi teaduslikus uurimistöös.
Käesolevas töös saab üliõpilane ettekujutuse genoomse DNA restriktsioonist, kloneermisest, raamatukogu-valmistamisest, PCR reaktsioonist, DNA sekveneerimisest, jt. molekulaarbioloogia põhilistest töömeetoditest. Iga üliõpilane esitab pärast töö teostamist protokolli (kas paberil või elektroonselt), milles toob ära põhilised tulemused ja lisaülesannete vastused. Kirjelduses märgib, millised etapid läbis edukalt ja millised olid probleemsed kohad.
Töö nr 1: Inimese genoomse DNA restriktsioon Cfr42I restriktaasi abil. Saadud fragmentide ligeerimine “Bluescript” pBS SK+ plasmiidi ehk vektorisse.
Lähteained:
– Inimese genoomne DNA ( 5 ng/μl.
(4) Inkubeeri toatemperatuuril kuni 24 h. Reaktsiooni võib alustada ka madalamal temperatuuril (näiteks 15 oC).
Inkubeerimisaegadel lahendada allpool toodud lisaülesanne, vt lisamaterjale ja kuula juhendaja näpunäiteid.
Lisaülesanded (teoreetilised):
1.1) Vaata Fermentase kataloogist, milline on Cfr42I jaoks kõige sobivam puhver (viie puhvri süsteemis). Millistes puhvrites see ensüüm veel töötab? Lisaks tutvu kataloogis olevate tingmärkidega (millisel temperatuuril ensüümid töötavad, kuidas neid inaktiveeritakse, milline on antud restriktaasiga lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus jne).
Kõige sobivam puhver viie puhvri süsteemis Cfr 421 jaoks on : B( blue ) 100 ja Tango ( yellow ) 50-100.
Ensüüm veel töötab G( green ) puhvris. Ensüümid töötavad 37 kraadi juures,lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus on 95%.
1.2) Kui restrikteerimiseks kasutada üheaegselt kahte erinevat ensüümi (näiteks Cfr42I ja PstI), siis milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)?
Kas Yello Tango puhvris oleks võimalik üheaegselt lõigata Cfr42I ja SmaI ensüümidega?
Kui kasutada üheagselt kahte erinevat ensüümi oleks mõistlikum kasutada Tango (yellow), G (green), B (blue).Yellow Tango puhvris ei ole võimalik üheaegselt lõigata Cfr421 ja Sma1 ensüümidega, kuna temperatuurid on erinevad.
1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA -Na2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2).
On vaja võtta:
400µl Tris –HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid.
1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert . Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne (ekvimolaarne) plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi?
On vaja võtta 20 ng inserti, et see oleks ekvimolaarne plasmiidiga. Tuleb võtta 60 ng inserti ,kui ligeerimisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi.
Insert- see fragment , mida kloonitakse.
Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse.
Lähteained:
– Ligeeritud genoomne DNA (6 μl).
– TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2.
– E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud ( valmistamist vaata lisast)
– Steriilne LB (lysogeny broth ) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl)
– agar
– Ampitsilliini (Amp) vesilahus , 100 mg/ml
– IPTG (isopropüültio- beta -D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus
– X-gal (5- bromo -4-kloro-3-indolüül-beta-D-galaktosiid), 20 mg/ml
– 70% Etanool .
Töö käik:
(1) Transformatsiooniks lahjenda saadud ligeerimissegu (6 μl) TE-ga 20 korda (1 osa ligeerimissegu ja 9-29 osa TE-d), sega korralikult ja pipeteeri 10 μl lahjendatud segu uude katseklaasi.
6*20-6114 μl TE.
(2) Transformatsioon:
10 μl ligeeritud DNA lahjendust
+ 20 μl E.coli DH5 alfa kompetentseid rakke (hoitakse 0 oC juures) (lahus peab kogu aeg olema külmas, kuna tegemist on elav rakkudega.)
Paiguta tuub jääle. Sega ettevaatlikult (näpuga), kompetentsed rakud on õrnad! Inkubeeri 30 min jääl, vahete-vahel segades.
(3) Teosta “ heat shock ”, viies tuub 5 minutiks 37 oC juurde; seejärel tagasi jääle.
“Heat shock“ viie minuti jooksul suurendab transformeerituse taset umbes 4 korda.
(4) Lisa 180 μl LB söödet, sega korralikult ning inkubeeri 37 oC 30 min (segamisega või ilma).( Segamine teeme sõrmega, kuna sees on elav rakkud.)
Inkubeerimise ajal valmista LB-Ampitsillini Petri tassid (vt. p5 allpool)
(5) Kahesajale milliliitrile LB söötmele lisa 3g Bacto-Agarit ja keeda mikrolaineahjus kuni agari täieliku sulamiseni ( ettevaatust , agaroos võib kergesti üle keeda. Selleks, et seda ei juhtuks, vali sobiva suurusega klaaskolb ja ahju reziim ning sega sagedasti). Seda tööd teosta grupi (~10 üliõpilast) peale juhendaja juuresolekul.
Arvuta: Kui palju on vaja võtta ampitsilliini kontsentratsiooniga 100 mg/ml 300 ml LB söötme kohta, et selle lõppkontsentratsioon oleks 100 μg/ml?
100mg/ml 100000 µg/ml
C1· C2 V1· V2
(6) Jahuta LB-agar 50-60 oC vesivannis alla ja seejärel lisa antibiootikum (Amp, 100 mg/ml) lõppkontsentratsioonini 100 μg/ml, sega korralikult ning vala välja Petri tassidele
(ca 15-20 ml ühele tassile). Liiga kuumas (>60 oC) söötmes antibiootikum laguneb! Tassid tarduvad ~15 min pärast.
Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar).
Nime tuleb kirjutada plaadi äärde, selleks et edasi oleks võimalik eristada sinised ja valged kolooniad .
(7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele:
Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 μl IPTG ja 10 μl X- gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi ! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid).
(8) Saadud segu (230 μl) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka . Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega.
(9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast. Seejärel eemalda tassid inkubaatorist (teeb juhendaja).
Tassid paneme ümberpööratult ,selleks et kondensaat ei tilgu agari peale.
(10) Interpreteeri tulemused (ligeerimise efektiivsus, kolooniate arv, jne.) ja vali üks valge koloonia minipreparatsiooniks (vt. järgmine töö). Need kolooniad tuleb 1,5 ml LB vedelsöötmesse kasvama panna praktikumi-eelsel päeval (kontakteeru ses suhtes juhendajaga).
TULEMUSTE INTERPRETEERIMINE:

• Pipeteerime katseklaasidesse 1.5 ml LB vedelsöödet.
  
• Juhendaja poolt saame meie Peetri tassid valgete ja siniste kolooniatega.
  
• Meil on vaja ainult valged kolooniad.
  
• Juhendajad märgistasid Peetri tasside peal sobivaid valged kolooniad ja andsid neile numbrid (1-…). Mõned valged kolooniad olid märgistatud küsimärkidega. Need kolooniad küsimärkidega me ei võta, sest nad on äärepeal või liiga lähedal üks teisele.
  
• Spetsiaalse pulgaga me võtame nummerdatud valged kolooniad ükshaaval ja paneme selle koloonia katseklaasi, kus on 1,5 ml LB vedelsööde. Katseklaasi peale paneme fooliumi.
  
• Jätame kõik kolooniad kasvama 37 kraadi juures.
  

Minu Peetri tassis oli 3 valget kolooniat numbritega 4, 5, 6. Edasi oma töös kasutan 6-nda kolooniat.
Lisaülesanded:
2.1) Võrdle antud transformatsiooni protokolli (mis on kasutusel GTI Molekulaarbioloogia laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused?
Me teeme transformatsiooni 37 kraadi juures, Sambrook´i raamatus 42 kraadi juures.
2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid?
Bakterikoloonia võib sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine, juhul, kui insert on väga väike ja ei muuda lugemisraami või kui järjestuses ei ole Stop-koodonit.
PCR, ühe või teise praimeriga sekveneerida järjestus, restriktsiooniga on võimalik määrat ,et selles koloonias on rekombinantne plasmiid.
2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata?
Meie bakterid on resistentsed Amp-le. Amp abil surevad teised bakterid ära ja me saame lihtsalt eristada vajalikud kolooniad.
2.4) Rakkude kompetentsus on nende võime vastu võtta DNA-d/plasmiidi. Ligeerimissegu transformatsiooniks võiks rakkude kompetentsus olla vähemalt 106. See tähendab, et 1 mikrogrammi plasmiidi transformatsioon annab Petri tassile 106 kolooniat. Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis kui palju tuleks DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat? Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis milline on rakkude kompetentsus?
Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis tuleks 0,1 ng DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat. Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis rakkude kompetentsus on 104.
Töö nr 3: Rekombinantse plasmiidse DNA minipreparatsioon.
Lähteained:
– Bakterikoloonia Nr.6 (sisaldab rekombinantset plasmiidi) kasvatatud Amp-LB vedel-söötmel 12-20 h (nn. „over night” ehk ON kultuur).
– Lahus I (50 mM glükoos, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA- Na2)
– Lahus II (0,1 N NaOH*, 1% SDS; * erineb sellest, mis on toodud DNA kokaraamatus; 0,1 N lahuse kasutamine 0,2 N asemel tõstab oluliselt DNA saagist ning võimaldab eraldada maksimaalse koguse superspiraalset plasmiidi vormi – K. Mätlik ja M. Speek, avaldamata andmed)
– Lahus III (5 M KOAc), säilit 4 oC juures)
– propanool
– TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2)
– Ribonukleaas A TE-s (5 μg/ml,; Sigma)
– Fenool , tasakaalustatud TE-ga (NB! Fenooli pipeteerida ainult kummikinnastes ja tõmbe all!).
– 70% ja 95% Etanool.
– 1 M Na-atsetaat (NaOAc), pH 5,5 (lisatakse DNA sadestamiseks)
– Agaroos (FMC)
– 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2)
– 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (5 x TBE, 20% glütserool, 0,01% Broomfenoolsinine)
– EtBr 5 μg/μl (pipeteerida kummikinnastega, kantserogeenne)

NB! Enne tööle asumist lugeda läbi fenooli ja etiidiumbromiidiga töötamise ohutuseeskiri ( http://geen.ttu.ee/?id=10705 , vt punkt C6. Fenooli ja etiidiumbromiidiga (EtBr) töötamine).

Töö käik:
(1) Vala ~1,4 ml bakteri ON kultuuri tuubi, sule tuub ja tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 1 min. Tuubid asetada tsentrifuugi nii, et tuubi ja kaant ühendav osa jääks väljapoole.
Tuubi selline asetus on vajalik selleks, et pärast fuugimist meile oleks selge kus kohas tuubis on sade.
(2) Eemalda supernatant sademe vastaspoolelt (ülemine vedeliku kiht, vt allpool olevalt skeemilt) (maksimaalselt!)
ülemine vedeliku kiht
ehk
supernatant
sade
pipetiots
ja suspendeeri bakterimass 200 μl Lahuses I. Sega hoolikalt (vortex), et tekiks ühtlane suspensioon . Kasuta vajadusel pipetti. Suspensiooni tegemiseks segame, kas näpu, Vortexi või puutikkuga.
(3) Lisa 400 μl lahust II (rakud lüüsuvad, valgud ja nukleiinhapped denatureeritakse), ning sega ettevaatlikult “end-over-end” stiilis (segajat mitte kasutada, see lõhub kromosomaalset DNA-d, mis võib sel juhul hiljem kaasa sadeneda!). Aseta tuub mõneks minutiks jääle.
(4) Lisa 300 μl jääkülma lahust III (valgud ja kromosomaalne DNA sadenevad välja, plasmiid renatureerub ja jääb lahusesse). Sega hoolikalt (nagu eelmises punktis). Hoia 2-3 min jääl.
Lahuse ülemises osas tekis valge sade.
(5) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 5-6 min (sademeks on kromosomaalne DNA). Samal ajal pane valmis uus tuub, millesse pipeteeri 400 μl propanooli (plasmiidse DNA & RNA sadestamiseks).
(6) Eemalda supernatant (~900 μl) ja kanna valmispandud tuubi. Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti).
(7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 μl TE + Ribonukleaasi A (5 μg/ml) lahuses (RNA lagundamiseks).Segame Vortexiga ja vuugime 1-2 minutit. Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2.
(8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale).
Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 μl EtBr (5 μg/μl). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn „ kamm “ või „hambad“. ~30 min pärast on geel tardunud .
Punkt 9 jääb vahele.
(9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks:
- lisa RNaasA-ga töödeldud DNA-le võrdses koguses fenooli (100 μl) (tõmbe all!!!)
- tsentrifuugi 1-2 min
- kanna vesikiht uude tuubi (~100 μl). Vesikihis on DNA ning valgud (RNaas) jäävad fenoolkihti ja vahekihti
- DNA sadestamiseks lisa vesikihile 1/20 osa (5 μl) NaOAc ja 3 mahtu (300 μl) 95% etanooli
- sega korralikult läbi
- tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min
- eemalda supernatant
- pesemiseks lisa sademele ~200 μl 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min
DNA
Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 μl TE-s. Selliselt eraldatud/ puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis ).
(10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust:
10 μl DNA-d
+ 2,5 μl 5 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla)
Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse „hambasse” ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. Kontroll pBS
Elektroforeesi tulemused: Minu minipreparatsioon
1kb marker
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
avatud vorm
superspiraalne vorm
kromosomaalne DNA
Lisaülesanded:
3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused?
Kokaraamatus lisatakse lahust III 150µl ,me lisasime lahust III 400µl. Kokaraamatus lisatakse lahust I 100 µl, me lisasime lahust I 200µl.
3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/μl 1 ml-s TE-s? Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada?
On vaja võtta 1ml RNaasA-d, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5ng/µl 1 ml- s TE- s. Tuleb lahjendada RNaasi 2000 korda.
3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli „hammastega“ ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või – elektroodi poole.
DNA on negatiivse laenguga. Geeli „hammastega“ ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni – elektroodi poole.
3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib?
EtBr on vajalik elektroforeesil, et visualiseerida meie tulemused ehk selleks, et elektroforeesi pildil oleks võimalik eristada meie inserdi erinevaid osasid. Veel EtBr aitab otsustada millal on õige aeg fooresi lõpetada.
Pärast kui DNA molekul on lahti keerdunud interakteerub EtBr lämmastikaluste vahel ja pärast fluorestseerib UV-kiirgusel.
3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks?
Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi.
Töö nr 4: Rekombinantse plasmiidi inserdi suuruse määramine restriktsiooni ja/või PCR abil
(kumba meetodit kasutada, otsusta eelmise töö põhjal, hinnates inserdi ligikaudset suurust)
Elektroforeesi tulemuste analüüsi käigus otsustati ,et minuga saadud insert on pikk ja sellega pole mõtet PCR-ga analüüsida. Inserdi suuruse määran restriktsiooni teel.
Lähteained:
– Rekombinantne DNA (~100 ng/μl)
– Restriktaas Cfr42I (SacII) (10u/μl, Fermentas ; http://www.fermentas.com/ ; vt lisa)
– Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust)
– Agaroos (FMC)
– 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2)
– 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver
– Molekulmassi marker (DNA, 1 kb või 100 bp “ ladder ”; 100-200 ng raja kohta)
– H2O
– 10 x PCR puhver (Fermentas)
– 25 mM MgCl2
– Taq DNA polümeraas, 5 u/μl (Fermentas)
– 2 mM dNTP (Fermentas)
– T3 ja T7 RNA polümeraasi promootori praimerid
AATTAACCCTCACTAAAGGG ja TAATACGACTCACTATAGGG, 100 ng/μl
Töö käik:
A: Restriktsioon
(1) Restriktsioon: 1) 20 µl plasmiidsed DNA-d 22 µl
2) 2 µl 10x restriktaasi puhvrit
Saadud 22 µl lahust jagan kaheks tuubiks, mõlemad 11 µl. Ühele tuubisse lisan 1 µl Cfr 421, teisele ei lisa, see on kontroll proov. Mõlemad tuubid inkubeerin 37 kraadi juures 1 tund.
(2) Analüüsi saadud restriktsioon 0,8% 1 x TBE- agaroos-geelil (valmistamist vt eelmine praktikum ). Iga üliõpilane kannab geelile kaks rada: kontroll ja restriktsioon: selleks lisada mõlemasse tuubi 10 μl 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhvrit (lilla). Ühisele geelile tuleb lisada ka molekulmassi marker DNA, mille abil on võimalik määrata inserdi suurust ja kui võimalik standard DNA, mille abil saab määrata uuritava DNA kogust.
B: PCR
(1) Kõigepealt lahjenda plasmiidset DNA-d (~100 ng/μl) 50-100 korda. Lahjendus teha TE-s.
(2) Koosta 100 μl PCR reaktsioonisegu ehk nn. “master-mix” (üks segu ~10 üliõpilase peale) järgnevatest komponentidest:
62 μl H2O
10 μl 10x Taq polümeraasi puhvrit
8 μl 25 mM MgCl2
10 μl 2 mM dNTP
5 μl mõlemat nii T3 ja T7 praimerit (100 ng/μl)
ja viimasena lisa 1 μl (5 ühikut) Taq polümeraasi (hoida jääl).
Seejärel kanna saadud kogus 9-10 μl kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali.
(3) Lisa PCR tuubi 1 μl (1-2 ng) lahjendatud DNA-d.
(4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil ( denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR’i.
(5) Samal ajal valmista ...% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda ... g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3.
(6) PCRi lõppedes (1000 nt) sekveneeritakse järestuse otstest kahe erineva vastassuunalise praimeriga kahes erinevas katseklaasis. Miks ei teostata sekveneerimist kahe erineva praimeriga ühes katseklaasis?
Kahe erineva praimeriga ei teostata sekveneerimist ühes katseklaasis, kuna sel juhul moodustub segasegment ja me ei saa sekveneerimise tulemuse näha.
5.4) Sekveneeritav DNA sade lahustatakse formamiidis, mis sisaldab 5 mM lõppkontsentratsiooniga EDTA-d (FA+EDTA lahus). Kui palju on vaja pipeteerida 800 μl FA+EDTA tegemiseks 0,5 M EDTA lahust?
On vaja pipeteerida 8µl 0,5M EDTA lahust.
Töö nr 6: Rekombinantse DNA järestuse bioinformaatiline analüüs (teostatakse auditooriumis/arvutiruumis või iseseisvalt)
(1) Saadud DNA järjestuse editeerimine, vastavalt saadud elektroforegrammile, kasutades programme MS Word, DNAMAN, Chromas, jt. plasmiidii osa lahutamine.
(2) DNA järjestuse võrdlemine andmepankades olevate tuntud järjestustega kasutades BLASTN, MEGABLAST, BLAST 2 sequences jt programme ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )
(3) “CpG island ”i identifitseerimine inimese kromosoomis (BLAT programm, http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat )
Proov nr.8.
CTGAATGGGGGCCCCCCCCCTCAGGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGGATATCGAATTCC
TGCAGCCCGGGGGATCCACTAGATTTAGAGCGGCCGCCACCGCGGCAGGCCGACGGCCCC
ACGGAGGGACATTGAAGGGGAAGTGGAGGAGAAGAGCAGGGGCGACCCGGAGGGGTGGCTGGGCCGGGGCGGGCAAGACAGTCTCAGGGCCCGGCAGCCGCCCGGGGTTGGCTAATTTCT
AGTTGTTGCCCCGCTCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGGAGGCCGCGGGGCCGCGCGAAG
GCTCGGGGTAGCAACGAGGCCCGGAGGGGGCCGAGCAGGGCGCCCCGCCCCGAGTCCCCG
CACCCGCGCCCGCCGGGTCCGCGTTCCAGCGCGTGCCTAGCAGTCCGCGCCTGGGGCCGG
GCGCTCACCGGACTTCGGAGGGTAGCGATAGGCCGAGTTCGCCTGGATGTCGATGTCCTC
CACCCCCGCGATGCGGCGGCTGAGAATGGAGCCCATGGTGCGCCGCGCTGCCGGGCAGAG
GGGCCAGGGCCGGAACGGGAGCGGCGACAGCGGCGGGGTCCTCA
Rohelised ja allakriipsutatud on Cfr421 saidid. Kollane “highlight“ on inserdi järjestus.
DNA järjestuse võrdlemine andmepankades olevate tuntud järjestusega kasutades BLAST.
>emb|AL359092.14|
Human DNA sequence from clone RP11-57C19 on chromosome 9 Contains
the 3' end of the FUBP3 gene for far upstream element (FUSE)
binding protein 3, an ribosomal protein L19 (RPL19) pseudogene,
the PRDM12 gene for PR domain containing 12, the gene
for RRP4 (homolog of yeast RRP4 (ribosomal RNA processing
4) 3'-5' exoribonuclease), the 5' end of two variants of the
ABL1 gene for v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene
homolog 1, a ribosomal protein L37 (RPL37) pseudogene and
three CpG islands, complete sequence
Length =173463
Score = 350 bits (189), Expect = 3e-93
Identities = 189/189 (100%), Gaps = 0/189 (0%)
Strand = Plus / Minus
Query 1 CCGCGGCAGGCCGACGGCCCCACGGAGGGACATTGAAGGGGAAGTGGAGGAGAAGAGCAG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 55971 CCGCGGCAGGCCGACGGCCCCACGGAGGGACATTGAAGGGGAAGTGGAGGAGAAGAGCAG 55912
Query 61 GGGCGACCCGGAGGGGTGGCTGGGCCGGGGCGGGCAAGACAGTCTCAGGGCCCGGCAGCC 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 55911 GGGCGACCCGGAGGGGTGGCTGGGCCGGGGCGGGCAAGACAGTCTCAGGGCCCGGCAGCC 55852
Query 121 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTAGTTGTTGCCCCGCTCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 55851 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTAGTTGTTGCCCCGCTCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 55792
Query 181 AGGCCGCGG 189
|||||||||
Sbjct 55791 AGGCCGCGG 55783
>gb|AC159112.2|
Pan troglodytes BAC clone CH251-495D16 from chromosome unknown,
complete sequence
Length=134235
Score = 333 bits (180), Expect = 3e-88
Identities = 186/189 (98%), Gaps = 0/189 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 CCGCGGCAGGCCGACGGCCCCACGGAGGGACATTGAAGGGGAAGTGGAGGAGAAGAGCAG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 71645 CCGCGGCAGGCCGACGGCCCCACGGAGGGACATTGAAGGGGAAGTGGAGGAGAAGAGCAG 71704
Query 61 GGGCGACCCGGAGGGGTGGCTGGGCCGGGGCGGGCAAGACAGTCTCAGGGCCCGGCAGCC 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 71705 GGGCGACCCGGAGGGGTGGCTGGGCCGGGGCGGGCAAGACAGTCTCAGGGCCCGGCAGCC 71764
Query 121 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTAGTTGTTGCCCCGCTCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 180
|||||||||||||||||||||| |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct 71765 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTACTTGTTGCCCCGCGCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 71824
Query 181 AGGCCGCGG 189
|||| ||||
Sbjct 71825 AGGCTGCGG 71833
>gb|AC156809.2|
Pan troglodytes BAC clone CH251-276J13 from chromosome unknown,
complete sequence
Length=168055
Score = 333 bits (180), Expect = 3e-88
Identities = 186/189 (98%), Gaps = 0/189 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 CCGCGGCAGGCCGACGGCCCCACGGAGGGACATTGAAGGGGAAGTGGAGGAGAAGAGCAG 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 94576 CCGCGGCAGGCCGACGGCCCCACGGAGGGACATTGAAGGGGAAGTGGAGGAGAAGAGCAG 94635
Query 61 GGGCGACCCGGAGGGGTGGCTGGGCCGGGGCGGGCAAGACAGTCTCAGGGCCCGGCAGCC 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 94636 GGGCGACCCGGAGGGGTGGCTGGGCCGGGGCGGGCAAGACAGTCTCAGGGCCCGGCAGCC 94695
Query 121 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTAGTTGTTGCCCCGCTCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 180
|||||||||||||||||||||| |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct 94696 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTACTTGTTGCCCCGCGCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 94755
Query 181 AGGCCGCGG 189
|||| ||||
Sbjct 94756 AGGCTGCGG 94764
“CpG island“i identifitseerimine inimese kromosoomis BLAT programmiga.
Minu kloneeritud järjestus on pärit NMU geeni regioonist chr 4.(positsioon chr4:56,475,804-56,475,988 ). Suurus: 185bp.