Immunoloogia praktikumi protokoll (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Immunoloogia
Praktikum
Õppejõud: Lilian Järvekülg
Õpilane: Agnes Kivistik
112483YAGB42
Tallinn 2012
SDS-PAGE ELEKTROFOREES
 Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi
järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist.
 Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis
annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH -
rühma tõttu.
 Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri.
Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega.
Töö käik:
1. Geeli valmistamine:
Lahutav geel (alumine Kontsentreeriv geel
geel), (Ülemine geel) , 4%
10%
Vesi 4,5 ml 3 ml
4x separating( stacking) 2,5 ml 1,25 ml
buffer
40% 2,5 ml 0,5 ml
acrylamide(AA)/bisacryl
amide 37,5:1 (Bio-Rad)
APS 100 µl 100 µl
TEMED 10 µl 10 µl
Lõpp-maht 10ml 5 ml
 Eeskirja järgi segame kõik komponendid kahte tuubi.
 APS ja TEMED on katalüsaatorid, kiirendades geeli tardumist.
 Geeli valmistamisel paneme APS-i mõlemasse tuubi korraga, aga
TEMED-i algul ainult alumise geeli tuubisse, sest lahused
polümeriseeruvad väga kiiresti.
 Paneme kokku vajaliku aparatuuri ja lisame kahe klaasi vahele alumist
geeli. Siis lisame natuke vett selleks, et geel tarduks kõikides kohtades
ühtlaselt. Kui alumine geel on tardunud valame vee välja, lisame
ülemise geeli tuubi TEMED-i ja valame kahe klaasi vahele. Paneme
hambad peale ja ootame, kuni geel tardub.
 Kui geel on tardunud võtame hambad ja klaasid ära ning paneme
geelid elektroforeesi vanni. Lisame vanni Running puhvrit.
 Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1proov; 2proov;Markes;
1proov; 2proov; 100 marker; 250 marker; 500 marker;
 Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min. (läks
natuke kauem)
Geel
1 2 M 1 2 100 250 500 Ülemine osa(4%)
Alumine osa(10%)
Immunoblot Geeli värvimine
 Pärast elektroforeesi toimumist võtame geel välja ja lõikame pooleks.
Väiksem osa läheb westernblotti ja suurem osa värvimisse.
Geeli värvimine.
 Suurema osa geeli värvime seguga: 25% isopropanool, 7% äädikhape,
0,1% Commasie Blue R.
 Laseme seista üleöö.
 Järgmisel päeval võtame geelid lahusest ära, puhastame 7%
äädikhappega ning pildistame.
170
M 1 2 100 250 500
130
100
70
55
40
35
25
15
10
Tulemused- uuritav üleekspresseeritud valk on umbes 45
kDA ja üle 250 mikrogrammi/milliliitri kohta.
marker
Immunoblot
Immunoblot on meetod, mis võimaldab uuritavas segus identifitseerida
kindlat valku, eeldusel, et on olemas sellevastane antikeha ning määrata
tema molekulaarmassi.
Töö koosneb kolmest etapist:
1. Valkude lahutamine SDS-polüakrüülamiid geelektroforeesil.
2. Valkude ülekandmine membraanile.
 Pärast elektroforeesi hoiame geeli bloti puhvris umbes 10 min.
 Valkude ülekandmine geelist membraanile bloti aparaadis. Selleks,
et seda teha, paneme bloti aparaadi anoodplaadi peale puhvris
olnud filter, siis puhvis olnud membraan, siis geel ja jälle filter.
Rullime kõik mullid välja ja paneme katoodplaat peale.
 Ülekanne toimub 15-25min, 10-15V.
 Pärast ülekannet, tuleb blokeerida membraani vaba osa, selleks
asetame membraani 3% BSA , 0,05% TBS/Tween-20 lahusele üheks
tunniks.
 Edasi toimub primaarse antikeha sidumine ja inkubeerimine 4
kraadi juures üleöö.
 Peseme membraani 4x5min TBS/Tween.
 Sekundaarse antikeha sidumine, inkubeerimine ja pesemine 2x
TBS/Tween ja 1x TBS.
3. Membraani visualiseerimine.
 Tõstame membraani kiledele ja kanname peale substraat
(SuperSignal West (Pierce) mõlemad 0,5ml) ja ootame 5 min.
 Visualiseerime membraani.
1 2 M
Ka siin on näha, et uuritavat valku on palju. Kõrval
olevale kontrollrajale on arvatavasti mingi saastus
tekkinud.
Direct ELISA.
Direct ELISA puhul sorbeeritakse antigeenid otse plastikule, seejärel
antigeenile külge ensüümiga konjugeeritud antikehad. Immuunreaktsiooni
tulemus visualiseeritakse ensüüm- substraat kompleksi värvusreaktsiooni
abil ja hinnatakse kvalitatiivselt ja/ või kvantitatiivselt värvireaktsiooni
intensiivsuse alusel mõõdetuna vastaval lainepikkusel.
Töö käik:
 Meil on olemas ELISA plaat 16-ne süvenditega. Süvenditesse me
kanname erinevate kontsentratsioonidega lehtede proovid viirusega
või viiruseta. L- terve, L+ viirusega
ELISA plaat
1 2  Igasse süvendisse kanname 100µl proovi.
A L- L- 1:10  Taimelehest eraldame mahl spetsiaalse
B L- L- 1:20 mahlapressi abil ja eppendorfi- tuubis
C L- L- 1:50 lahjendame selle vajaliku
D L- L- 1:10
kontsentratsioonini PBS-ga.
0  Plaadilt eemaldame mitteseostunud
E L+ L+ 1:5
antigeeni ja peseme plaate 4x PBS/ Tw-ga
F L+ L+ 1:10
G L+ L+ 1:50 ja 1x PBS- ga.
H L+ L+ 1:10  Plaati blokeerime 1% BSA lahusega PBS/
0 Tw-s 1.5 tundi ruumitemperatuuril,
eemaldame blokeeriva lahuse ja peseme
3x PBS/Tw-ga.
 Plaadile kanname ensüümiga konjugeeritud antikeha, lahjendus 1:500
(PBS+ 4µl lahust nr.1). Inkubeerime 1.5 tundi 37 kraadi juures.
Konjugaadi eemaldame ja peseme 4x PBS/Tw-ga ja 1x PBS-ga.
 Peroksüdaasi substraadi lahust, ensüümreaktsiooni katalüsaator
kantakse süvenditesse . Värvusreaktsiooni mõõdetakse lainepikkusel
ƛ450.
Tulemus: