Molekulaarbioloogia praktikumi protokoll (0)

Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2013 a) Nimi:
YAGB41
Inimese genoomi CpG “saarekestel” paiknevate geenide kloneerimine
(genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon ,
rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine , bioinformaatiline analüüs)
Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands ). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin metüleeritakse (replikatsioonijärgselt aitab eristada värskelt sünteesitud DNA ahelat vanast ahelast ). Ekspresseeruvate geenide promootorpiirkondi ei metüleerita. Metüleeritud tsütosiin allub kergesti spontaansele desamineerimisele, tekib tümiin (reparatsiooniensüüm tümiin-DNA-glükosülaas eemaldab vigasest T/G paarist T väga väikese efektiivsusega) – seega jääb alles väga väike osa CpG järjestustest.
Seetõttu on CpG dinukleotiid evolutsiooniliselt säilunud ainult seal, kus tsütosiin ei ole metüleeritud, st ekspresseruvate geenide promootorpiirkondades.
TSÜTOSIIN 5-METÜÜLTSÜTOSIIN TÜMIIN
Selleks, et eraldada selliseid saari ülejäänud genoomi suuresti A-T rikastest piirkondadest oleks sobiv kasutada restriktaasi, mis hüdrolüüsib C-G järjestusi (näiteks Cfr42I (SacII), CCGC’GG; NotI GC’GGCCGC;). Need restriktaasid on reeglina tundlikud C metülatsioonile CmpG järjestuses, võimaldades restrikteerida seega aktiivseid geene (inaktiivsed võivad olla metüleeritud).
Seega on antud töö eesmärgiks kloneerida CpG saarekestel paiknevaid geene, täpsemalt geenide regulaatoralasid ja saadud järjestuste kuuluvus teha kindlaks DNA järjestuste määramise (sekveneerimise) abil. Saadud töö tulemused võivad leida kasutust molekulaargeneetika laboratooriumi teaduslikus uurimistöös.
Käesolevas töös saab üliõpilane ettekujutuse genoomse DNA restriktsioonist, kloneermisest, raamatukogu-valmistamisest, PCR reaktsioonist, DNA sekveneerimisest, jt. molekulaarbioloogia põhilistest töömeetoditest. Iga üliõpilane esitab pärast töö teostamist protokolli (kas paberil või elektroonselt), milles toob ära põhilised tulemused ja lisaülesannete vastused. Kirjelduses märgib, millised etapid läbis edukalt ja millised olid probleemsed kohad.
Töö nr 1: Inimese genoomse DNA restriktsioon Cfr42I restriktaasi abil. Saadud fragmentide ligeerimine “Bluescript” pBS SK+ plasmiidi ehk vektorisse.
Lähteained:
– Inimese genoomne DNA ( 5 ng/μl.
(4) Inkubeeri toatemperatuuril kuni 24 h. Reaktsiooni võib alustada ka madalamal temperatuuril (näiteks 15 oC).
Inkubeerimisaegadel lahendada allpool toodud lisaülesanne, vt lisamaterjale ja kuula juhendaja näpunäiteid.
Lisaülesanded (teoreetilised):

Vaata Fermentase kataloogist, milline on Cfr42I jaoks kõige sobivam puhver (viie puhvri süsteemis). Millistes puhvrites see ensüüm veel töötab? Lisaks tutvu kataloogis olevate tingmärkidega (millisel temperatuuril ensüümid töötavad, kuidas neid inaktiveeritakse, milline on antud restriktaasiga lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus jne).
Kõige sobivamad on puhver B, G ja Tango . Ensüümid töötavad 37 kraadi juures, inaktiveeruvad 65 kraadi juures, efektiivsus 95%, tundlik CpG metülatsioonile.
1.2) Kui restrikteerimiseks kasutada üheaegselt kahte erinevat ensüümi (näiteks Cfr42I ja PstI), siis milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)?
Kas Yello Tango puhvris oleks võimalik üheaegselt lõigata Cfr42I ja SmaI ensüümidega?
Parim B, sobivad ka G ja Tango. Tango puhvris on võimalik lõigata üheaegselt nende ensüümidega, kuid kuna nad on aktiivsed erinevatel temperatuuridel , siis on efektiivsus suhtselt madal.
1.3) Kui palju tuleb võtta 1 M Tris-HCl, 5 M NaCl, 20% SDS ja 0,5 M EDTA -Na2 lahuseid, et valmistada 1 ml 2 x PK puhvrit (0,4 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,44 M NaCl, 2% SDS, 25 mM EDTA-Na2).
400µl Tris –HCl, 88µl NaCl, 100 µl SDS ja 50 µl EDTA-Na2 lahuseid
1.4) On vaja ligeerida 100 ng 5000 bp pikkune plasmiid ja 1000 bp pikkune insert. Mitu ng tuleb võtta inserti, et see oleks ekvivalentne plasmiidiga (arvesse tuleb võtta nende 5-kordset pikkuste erinevust)? Mitu ng tuleks inserti võtta, kui ligeermisreaktsiooni panna inserti 3 korda rohkem kui ekvivalentne kogus plasmiidi?
Ekvivalentne kogus oleks 20 ng (1000bp*100ng/5000bp). Tegelikkuses peaks võtma 3x rohkem ehk 60 ng.
Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse.
Lähteained:
– Ligeeritud genoomne DNA (6 μl).
– TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2.
– E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud ( valmistamist vaata lisast)
– Steriilne LB (lysogeny broth ) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl)
– agar
– Ampitsilliini (Amp) vesilahus , 100 mg/ml
– IPTG (isopropüültio-beta-D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus
– X-gal (5- bromo -4-kloro-3-indolüül-beta-D-galaktosiid), 20 mg/ml
– 70% Etanool .
Töö käik:
(1) Transformatsiooniks lahjenda saadud ligeerimissegu (6 μl) TE-ga 10-30 korda (1 osa ligeerimissegu ja 9-29 osa TE-d), sega korralikult ja pipeteeri 10 μl lahjendatud segu uude katseklaasi.
Võtsin 3 μl ligeerimissegu ja 6 μl TE-d ( tegin 3-kordse lahjenduse).
(2) Transformatsioon:
10 μl ligeeritud DNA lahjendust 9 μl 3-kordset lahjendust
+ 20 μl E.coli DH5 alfa kompetentseid rakke (hoitakse 0 oC juures)
Paiguta tuub jääle. Sega ettevaatlikult (näpuga), kompetentsed rakud on õrnad! Inkubeeri 30 min jääl, vahete-vahel segades.
(3) Teosta “ heat shock”, viies tuub 5 minutiks 37 oC juurde; seejärel tagasi jääle.
(4) Lisa 180 μl LB söödet, sega korralikult ning inkubeeri 37 oC 30 min (segamisega või ilma).
Inkubeerimise ajal valmista LB-Ampitsillini Petri tassid (vt. p5 allpool)
(5) Kahesajale milliliitrile LB söötmele lisa 3g Bacto-Agarit ja keeda mikrolaineahjus kuni agari täieliku sulamiseni (ettevaatust, agaroos võib kergesti üle keeda. Selleks, et seda ei juhtuks, vali sobiva suurusega klaaskolb ja ahju reziim ning sega sagedasti). Seda tööd teosta grupi (~10 üliõpilast) peale juhendaja juuresolekul.
Arvuta: Kui palju on vaja võtta ampitsilliini kontsentratsiooniga 100 mg/ml 200 ml LB söötme kohta, et selle lõppkontsentratsioon oleks 100 μg/ml? 200 μl (100*200ml/100000ml)
(6) Jahuta LB-agar 50-60 oC vesivannis alla ja seejärel lisa antibiootikum (Amp, 100 mg/ml) lõppkontsentratsioonini 100 μg/ml, sega korralikult ning vala välja Petri tassidele
(ca 15-20 ml ühele tassile). Liiga kuumas (>60 oC) söötmes antibiootikum laguneb! Tassid tarduvad ~15 min pärast.
Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar).
(7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele:
Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 μl IPTG ja 10 μl X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi ! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad , mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid).
(8) Saadud segu (230 μl) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka . Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega.
(9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast. Seejärel eemalda tassid inkubaatorist (teeb juhendaja).
(10) Interpreteeri tulemused (ligeerimise efektiivsus, kolooniate arv, jne.) ja vali üks valge koloonia minipreparatsiooniks (vt. järgmine töö). Need kolooniad tuleb 1,8 ml LB vedelsöötmesse kasvama panna praktikumi-eelsel päeval (kontakteeru ses suhtes juhendajaga).
Lisaülesanded:
2.1) Võrdle antud transformatsiooni protokolli (mis on kasutusel GTI Molekulaarbioloogia laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused?
Meie inkubeerime 5min 37 kraadi juures, kokaraamatus 1,5min 42 kraadiga.
2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid?
Avatud lugemisraam, stop- koodon puudub või kui initsiatsioon algab meie inserdist. Määrata saab restriktsiooniga, kui multikloneerimissaidis on restriktaas SacII.
2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata?
Võivad hakata kasvama muud bakterikolooniad, mitte plasmiidi sisaldavad bakterid . Meile olulised plasmiidi sisaldavad bakterid on Amp’ile resistentsed ning suudavad selles keskkonas kasvada.
2.4) Rakkude kompetentsus on nende võime vastu võtta DNA-d/plasmiidi. Ligeerimissegu transformatsiooniks võiks rakkude kompetentsus olla vähemalt 106. See tähendab, et 1 mikrogrammi plasmiidi transformatsioon annab Petri tassile 106 kolooniat. Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis kui palju tuleks DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat? Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis milline on rakkude kompetentsus?
Kui rakkude kompetentsus on 106, siis tuleks 0,1 ng DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat. Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis rakkude kompetentsus on 104.
Töö nr 3: Rekombinantse plasmiidse DNA minipreparatsioon.
Lähteained:
– Bakterikoloonia (sisaldab rekombinantset plasmiidi) kasvatatud Amp-LB vedel-söötmel 12-20 h (nn. „over night ” ehk ON kultuur).
Meie rühmas oli kolooniate arv väike, st transformatsiooni efektiivsus oli madal. Rakud olid säilitusel kaotanud kompetentsuse.
– Lahus I (50 mM glükoos, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA- Na2)
– Lahus II (0,1 N NaOH *, 1% SDS; * erineb sellest, mis on toodud DNA kokaraamatus; 0,1 N lahuse kasutamine 0,2 N asemel tõstab oluliselt DNA saagist ning võimaldab eraldada maksimaalse koguse superspiraalset plasmiidi vormi – K. Mätlik ja M. Speek, avaldamata andmed)
– Lahus III (5 M KOAc), säilit 4 oC juures)
– propanool
– TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2)
– Ribonukleaas A TE-s (5 μg/ml,; Sigma)
– Fenool , tasakaalustatud TE-ga (NB! Fenooli pipeteerida ainult kummikinnastes ja tõmbe all!).
– 70% ja 95% Etanool.
– 1 M Na-atsetaat (NaOAc), pH 5,5 (lisatakse DNA sadestamiseks)
– Agaroos (FMC)
– 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2)
– 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (5 x TBE, 20% glütserool, 0,01% Broomfenoolsinine)
– EtBr 5 μg/μl (pipeteerida kummikinnastega, kantserogeenne)

NB! Enne tööle asumist lugeda läbi fenooli ja etiidiumbromiidiga töötamise ohutuseeskiri ( http://geen.ttu.ee/?id=10705 , vt punkt C6. Fenooli ja etiidiumbromiidiga (EtBr) töötamine).

Töö käik:
(1) Vala ~1,4 ml bakteri ON kultuuri tuubi, sule tuub ja tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 1 min. Tuubid asetada tsentrifuugi nii, et tuubi ja kaant ühendav osa jääks väljapoole.
(2) Eemalda supernatant sademe vastaspoolelt (ülemine vedeliku kiht, vt allpool olevalt skeemilt) (maksimaalselt!)
sade
ülemine vedeliku kiht
ehk
supernatant
pipetiots
ja suspendeeri bakterimass 200 μl Lahuses I. Sega hoolikalt (vortex), et tekiks ühtlane suspensioon . Kasuta vajadusel pipetti.
(3) Lisa 400 μl lahust II (rakud lüüsuvad, valgud ja nukleiinhapped denatureeritakse), ning sega ettevaatlikult “end-over-end” stiilis (segajat mitte kasutada, see lõhub kromosomaalset DNA-d, mis võib sel juhul hiljem kaasa sadeneda!). Aseta tuub mõneks minutiks jääle.
(4) Lisa 300 μl jääkülma lahust III ( valgud ja kromosomaalne DNA sadenevad välja, plasmiid renatureerub ja jääb lahusesse). Sega hoolikalt (nagu eelmises punktis). Hoia 2-3 min jääl.
(5) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 5-6 min (sademeks on kromosomaalne DNA). Samal ajal pane valmis uus tuub, millesse pipeteeri 400 μl propanooli (plasmiidse DNA & RNA sadestamiseks).
(6) Eemalda supernatant (~900 μl) ja kanna valmispandud tuubi. Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti).
(7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 μl TE + Ribonukleaasi A (5 μg/ml) lahuses (RNA lagundamiseks). Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2.
1) suurem osa 1000 μl pipetigakiirtsentrifuug
2) väiksema pipetiga eemaldasin ülejäänu supernatandi
(8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale).
Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 μl EtBr (5 μg/μl). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn „ kamm “ või „hambad“. ~30 min pärast on geel tardunud .
(9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks:
- lisa RNaasA-ga töödeldud DNA-le võrdses koguses fenooli (100 μl) (tõmbe all!!!)
- tsentrifuugi 1-2 min
- kanna vesikiht uude tuubi (~100 μl). Vesikihis on DNA ning valgud (RNaas) jäävad fenoolkihti ja vahekihti
- DNA sadestamiseks lisa vesikihile 1/20 osa (5 μl) NaOAc ja 3 mahtu (300 μl) 95% etanooli
- sega korralikult läbi
- tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min
- eemalda supernatant
- pesemiseks lisa sademele ~200 μl 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min
DNA
Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 μl TE-s. Selliselt eraldatud/ puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis ).
Ei teinud, sest lahus oli piisavalt puhas.
(10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust:
2-3 μl DNA-d 2,5 μl DNA-d
+ 10 μl 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla)
Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse „hambasse” ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures.
Plasmiidi eraldamine õnnestus, alumine pilv on RNA jääk, mida ei tohiks olla puhtuse mõttes.
Lisaülesanded:
3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused?
Punktis 7 pestakse lahust 70% etanooliga.
3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/μl 1 ml-s TE-s? Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada?
On vaja võtta 1ml RnaasA-d, 2000x.
3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli „hammastega“ ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või – elektroodi poole.
DNA on negatiivse laenguga, tuleb asetada – eletroodi poole.
3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib?
DNA nähtavaks tegemiseks (EtBr interakteerub lämmastikaluste vahele ning hiljem UV-valguses fluorestseerub), vähendab DNA laengut (DNA muutub pikemaks ja jäigemaks).
3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks?
Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi.
Töö nr 4: Rekombinantse plasmiidi inserdi suuruse määramine restriktsiooni ja/või PCR abil
(kumba meetodit kasutada, otsusta eelmise töö põhjal, hinnates inserdi ligikaudset suurust)
Kasutame PCR-i. Restriktsiooni ei saa kasutada, sest meie inserdid on