Immunoloogia praktikumi protokoll (1)

Tallinna Tehnikaülikool - Meditsiin - Immunoloogia i

5 VÄGA HEA

Tallinna Tehnikaülikool
Immunoloogia
Praktikum
Õppejõud: Lilian Järvekülg
Õpilane:
YAGB-42
Tallinn 2012
SDS-PAGE ELEKTROFOREES

Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist.
Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu.
Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker - valkude segu, mis on kindla suurusega.

Töö käik:

Geeli valmistamine:
Lahutav geel (alumine geel),
10%
Kontsentreeriv geel (Ülemine geel) , 4%
Vesi
4,5 ml
3 ml
4x separating( stacking) buffer
2,5 ml
1,25 ml
40% acrylamide(AA)/bisacrylamide 37,5:1 (Bio-Rad)
2,5 ml
0,5 ml
APS
100 µl
100 µl
TEMED
10 µl
10 µl
Lõpp-maht
10ml
5 ml

Eeskija järgi segame kõik komponendid kahe tuubisse.
APS ja TEMED on katalüsaatorid. Nad kiirendavad valgu tardumist.
Geeli valmistamisel paneme APS-i mõlemasse tuubisse korraga, aga TEMED-i esi algul ainult alumise geeli tuubisse, sest lahused polümeriseeruvad väga kiiresti.
Paneme kokku vajaliku aparatuuri ja lisame kahe klaasi vahele alumist geeli. Siis lisame natuke vett selleks ,et geel tarduks kõikides kohtades ühtlaselt. Kui alumine geel on tardunud valame vesi välja ,lisame ülemise geeli tuubisse TEMED-i ja valame kahe klaasi vahele. Paneme „ kamm “ peale ja ootame ,kuni geel tardub.
Kui geel on tardunud võtame „kamm“ ära, seejärel võtame klaasid ära ja paneme geelid freesi vanni. Lisame vanni „ Running „puhvrit.
Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras: 1; 2;M; 1; 2; 0,5; 1; 1,5;
Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min.

Geel
1 2 M 1 2 0,5 1 1,5 Geeli värvimine
Immunoblot
Ülemine osa
Alumine osa

Pärast elektroforeesi toimumist võtame geel välja ja lõikame pooleks. Väiksem osa läheb immunoblotti ja suurema osa värvime.

Geeli värvimine.

Suurema osa geeli värvime seguga : 25% isopropanool, 7% äädikhape, 0,1% Commasie Blue R.
Laseme seista üleöö.
Järgmisel päeval võtame geelid lahusest ära ja pildistame neid.

170
130
100
70
55
40
35
25
15
10
Markerite suuruse järgi määrame uuritava valgu suurus. Seega minu uuritava valgu suurus on liigi kaudu 25 Da.
Immunoblot. marker
Uuritav valk
Immunoblot on meetod, mis võimaldab uuritavas segus identifitseerida kindlat valku, eeldusel , et on olemas sellevastane antikeha ning määrata tema molekulaarmassi.
Töö koosneb kolmest etapist:

Valkude lahutamine SDS-polüakrüülamiid geelektroforeesil.

Valkude ülekandmine membraanile.

Pärast elektroforeesi hoiame geeli bloti puhvris umbes 10 min.
Valkude ülekandmine geelist membraanile bloti aparaadis. Selleks, et seda teha, paneme bloti aparaadi anoodplaadi peale puhvris olnud filter , siis puhvis olnud membraan , siis geel ja jälle filter. Rullime kõik mullid välja ja paneme katoodplaat peale.
Ülekanne toimub 15-25min, 10-15V.
Pärast ülekannet, tuleb blokeerida membraani vaba osa, selleks asetame membraani 3% BSA , 0,05% TBS/ Tween -20 lahusele üheks tunniks.
Edasi toimub primaarse antikeha sidumine ja inkubeerimine 4 kraadi juures üleöö.
Peseme membraani 4x5min TBS/Tween.
Sekundaarse antikeha sidumine, inkubeerimine ja pesemine 2x TBS/Tween ja 1x TBS.

Membraani visualiseerimine.

Tõstame membraani kiledele ja kanname peale substraat (SuperSignal West ( Pierce ) mõlemad 0,5ml) ja ootame 5 min.
Visualiseerime membraani.

Tulemus näitab meile, et kogu meie valk on kondenseerunud ühe piirkonna ja katse oli sooritatud korrektselt.
Direct ELISA.
Direct ELISA puhul sorbeeritakse antigeenid otse plastikule, seejärel antigeenile külge ensüümiga konjugeeritud antikehad . Immuunreaktsiooni tulemus visualiseeritakse ensüüm- substraat kompleksi värvusreaktsiooni abil ja hinnatakse kvalitatiivselt ja/ või kvantitatiivselt värvireaktsiooni intensiivsuse alusel mõõdetuna vastaval lainepikkusel.
Töö eesmärk: Kartuli viiruse X määramine.
Töö käik:

Meil on olemas ELISA plaat 16-ne süvenditega. Süvenditesse me kanname erinevate kontsentratsioonidega lehte ja mugula proovid viirusega või viiruseta.

ELISA plaat
1
2
A
L-
L-
1:10
B
L-
L-
1:20
C
L+
L+
1:10
D
L+
L+
1:100
E
M-
M-
1:10
F
M+
M+
1:10
G
PBS+Viir.
PBS
H
PBS
PBS

Igasse süvendisse kanname 100µl proovi.
Taimelehest eraldame mahl spetsiaalse mahlapressi abil ja eppendorfi- tuubis lahjendame teda vajaliku kontsentratsioonini PBS-ga. Tuleb välja kaks proovi 1:10 ja 1:20, need on proovid ilma viiruseta.
Lehe proovi viirusega saame õppejõust.
Edasi valmistame mugulamatrejalist mugula proovi viirusega. Selleks võtame umbes 1g mugulat ja pressitakse välja mugula mahl, lahjendame teda PBS-ga vajaliku kontsentratsioonini.
Mugula proovi viiruseta saame õppejõust.
Kanname kõik proovid vastavasse süvenditesse. Süvendisse G kanname PBS ja viiruse (nr.7).
Plaadilt eemaldame mitteseostunud antigeen ja peseme plaate 4x PBS/ Tw-ga ja 1x PBS- ga.
Plaat blokeerime 1% BSA lahusega PBS/ Tw-s 1.5 tundi ruumitemperatuuril, eemaldame blokeeriv lahus ja peseme 3x PBS/Tw-ga.
Plaadile kanname ensüümiga konjugeeritud antikeha, lahjendus 1:500 (PBS+ 4µl lahust nr.1). Inkubeerime 1.5 tundi 37 kraadi juures. Konjugaat eemaldame ja peseme 4x PBS/Tw-ga ja 1x PBS-ga.
Peroksüdaasi substraadi lahus ja ensüümreaktsiooni katalüsaator kanname süvenditesse . Värvusreaktsiooni mõõdetakse lainepikkusel ƛ450.

Töö tulemus:
ELISA plaat
1
2
A
0,046
0,051
1:10
B
0,050
0,44
1:20
C
0,060
0,059
1:10
D
0,052
0,061
1:100
E
0,053
0,051
1:10
F
1,728
1,669
1:10
G
0,048
0,044
H
0,232
0,071
Katse tulemus näitab ,et plaati süvendites on olemas kartuli X viirus .
Kahekordne radiaalne immunodifusioon.
Meetodit kasutatakse antigeenide ja antikehade identifitseerimiseks ja kvalitatiivseks analüüsiks rakuekstraktides, seerumites. Meetod on spetsiifiline ja tundlik, kui antigeen/ antikeha suhe on optimaalne.
Töö käik:

Peetri tassis , kus on tardunud agaroosgeel teeme 7 süvendit vastava šablooniga „ lilleke “.
Teeme antigeeni BSA vastavad proovilahjendused (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64).Igasse auku kanname 10µl proovi.
Keskele kanname 10µl antikeha (anti-BSA polüklonaalsed antikehad).
Tass asetame külmutuskappi 4 kraadi juurde.

Töö tulemus:
Minu tassis oli optimaalne antigeen/antikeha suhe 1:64 lahuse juures.

.DOCX Laadi alla originaalfail 5 lk · .docx · 100 allalaadimist

100 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 100 punkti.

~ 5 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2012-05-04 Kuupäev, millal dokument üles laeti

100 laadimist Kokku alla laetud

1 arvamus Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

AnnaLogunova Õppematerjali autor

praktikumi protokoll

sds elisa immunoblot immunoloogia sds-page elektroforees

Sarnased õppematerjalid

docx

Immunoloogia praktikumi protokoll

Tallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES  Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist.  Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu

Immunoloogia i

docx

Immunoloogia praktikumi protokoll

Tallinna Tehnikaülikool IMMUNOLOOGIA Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB41 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,, laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD). Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine geel), Kontsentreeriv geel (ülemine 10% geel) , 4% Vesi

Meditsiin

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia

Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne YAGB41 Kevad 2014 Vlada Šiposa Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne 1. Praktikum – pipepteerimine. Töötasime erineva suuruse pipettiga: 1000, 200, 20 ning 10 µl. Igale pipettile sobib oma suurusega otsik. Otsikud on steriilsed ja neid ei tohi neid näpuga katsuda. Pärast kasutamist tuleb otsikud ära visata spetsiaalsele konteinerisse. Otsik peab istuma tihkelt, kuna kui istub liiga lõdvelt, siis sissetõmbav kogus on tegelikult vähem, kui oodetud (tõmmatakse sisse ka õhk)

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

seda on väga palju. Milline aine ja kuidas seob kolonnis DNA-d? Milline elueerimispuhvri omadus aitab DNA kolonnist välja elueerida? Kolonnis olev ränioksiin seob DNA, nii, et DNA seob fosfaatselgroogupidi ränioksiidiga. (seondumisele aitab kaasa, eelnev ADB puhver). Elueerimispuhvri omadustest on kõige olulisemad madal soolasisaldus ja aluseline pH. Millist olulist infot saan kolonnide kohta firma kodulehelt? Kas kasutatud kit sobis antud praktikumi töö teostamiseks, millest seda järeldada? Aeg 15 minutit Vajatav varustus Tsentrifuug DNA suurus 50bp kuni 23kb Sobivad proovid DNA TAE/TBE puhvriga agaroosgeelist DNA puhtus Kõrge kvaliteedi, puhtusega DNA, mis on sobilik sekveneerimiseks,

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaar- ja rakubioloogia

Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-Loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum Aruanne Koostanud: Luise Tiks YASB61 112332 Tallinn 2014 Pipeteerimine Harjutus 1 1 ml pipetti kasutades pipeteerisin 15-ml falconisse 1,65 ml detergenti, 3,85 ml vett (kokku 5,5 ml 30% lahust). Detergendi pipeteerimiseks kasutasin pahupidi tehnikat.

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Molekulaarbioloogia protokoll

Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi: Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin metüleeritakse (replikatsioonijärgselt aitab eristada värskelt sünteesitud DNA ahelat vanast ahelast). Ekspresseeruvate geenide promootorpiirkondi ei metüleerita. Metüleeritud tsütosiin allub kergesti spontaansele de

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Molekulaarbioloogia aruanne

Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum YTM0012 MOLEKULAARBIOLOOGIA PRAKTIKUM Pipeteerimine Automaatpipetiga pipeteerimise põhitõed  Pipeteerimisel on kõige olulisem võtta õige suurusega pipett  Pipeteeritav vedelik peab olema homogeenne. Seintelt ja korgi küljest tuleks tilgad ja kondensaat põhja fuugida  Enne pipeteeritavasse lahusesse viimist vajuta kolb esimese astmeni alla. Pipeti tühjenemiseks on vaja vajutada kolb teise astmeni. Viskoosse lahuse pipeteerimine

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

170

pdf

Meditsiinilise mikrobioloogia praktikum

Tartu Ülikool Mikrobioloogia instituut Meditsiinilise mikrobioloogia praktikum II osa Tatjana Brilene, Kai Truusalu, Tõnis Karki 2014/2015 1 Sisukord 1. Mikrobioloogilise diagnostika põhiskeem. Stafülokokknakkuste diagnostika. Streptokokknakkuste diagnostika..................................3 2. Enterobakterite nakkuste diagnostika uroinfektsioonide näitel............................................12 3. Enterobakterite nakkuste diagnostika sooleinfektsioonide näitel....................

Bioloogia

Rohkem sarnaseid