Kui proov oli liikunud täidisesse viidi kiiresti pipeti abil geeli pinnale väike kogus voolutit ja lasti sellel sisse imbuda. Seda korrati seni, kuni oldi veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud. Siis kanti geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Ja lisati seda pidevalt vastavalt vajadusele Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) lähenes kolvi põhjale, siis eemaldati kolb ja alustati eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Ühendatud fraktsioonis olev eluaat on osa dekstraansinise elueerimismahust, seega tuli see ära mõõta. Elueerimine lõpeteti kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektromeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone polnud vaja mõõta. Tulemused esitati kromatogrammina. TULEMUSED JA NENDE INTERPRETATSIOON
keskel, umbes poole cm kaugusel geeli pinnast. Proov kantakse geeli pinnale võimalikult ühtlaselt. Pärast proovi lisamist avatakse väljavool kolonnist ja lisatakse väike kogus voolutuslahust. Seda korratakse mõned korrad ning alles siis lisatakse voolutuslahust terve kolonni täitumiseni. Voolutuslahust peab esialgu lisama väikeste koguste kaupa, et kogu uuritav proov ühtlaselt geeli sisse läheks. Voolutuslahust tuleb lisada pidevalt, et kolonn kuivaks ei jääks. Kõigepealt kogutakse eluaat väiksesse keeduklaasi. Ühendatud fraktsiooni maht on 23 ml. Eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonide kaupa alustatakse veidi enne dekstraansinise väljumist. Seejärel kogutakse eluaati 2 ml fraktsioonide kaupa eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse kuni pärast viimase, kollase aine väljumist on eluaat värvusetuks muutunud. Kokku kogusin eluaati 37-sse katseklaasi. Arvutuste järgi oleks pidanud kasutama (75,58-23)/2 = 27 katseklaasi. 27 katseklaasi
Seda korratakse seni, kuni ollakse veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud. Siis kantakse geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) läheneb kolvi põhjale, siis eemaldatakse kolb ja alustatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Kogu voolutuse käigus tuleb jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele lisada ning vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimine lõpetatakse kui väljub viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektrofotomeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht:
Avati kolonni väljavooluava ning vedelikku koguti väiksesse keeduklaasi, kuni vedeliku tase oli jõudnud täidise pinnani. Kolonni väljavooluava suleti. 0,5 ml automaatpipetiga sisestati kolonni uuritav proov, avati kolonni väljavool ning esialgu väljuvat eluaati koguti väiksesse mõõtsilindrisse. Kui kolonnis liikuv esimene sinine riba oli jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks. Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht:
täielikult geeli sisenenud, hakatakse juurde lisama eluenti, alguses väiksemate kogustena jälgides, et geel ei jääks kuivaks · kuni kolonni allaossa jõuab dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti, mis kogutakse ühendatud fraktsioonina kuiva 100 ml kolbi · ühendatud fraktsioon 16,75 ml · 2ml suuruseid fraktsioone kogutakse, kuni kogu uuritav aine on kolonnist väljunud ja eluaat on värvitu Fraktsiooni analüüsimine Aine kontsentratsioon igas fraktsioonis väljendatakse lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetritel. Sinised fraktsioonid mõõdetakse lainepikkusel 670nm, pruunid lainepikkusel 410nm ja kollased lainepikkusel 360nm. Koostatakse katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele
· Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. · Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. · Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine · Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. · Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. · Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi
kaugusele geeli pinnast. Proov lastakse tilkuda geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Kui proov on sisestatud, avasin väljavool ja lisasin kiiresti pipeti abil väike kogus eluneti (NaCl). Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel lisasin suurema koguse voolutuslahust. Kui esimene värviline riba hakkas lähenema kolonni alumisele osale alustasin eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. Elueerimist lõpetasin, kui väljuv eluaat on värvitu. Analüüsisin võetud proovid spekrofotomeetriga, tegin vastavaid arvutusi ja kõveraid. Mõõtmised Sephadex'i mark = G75 k = 0,1 l = 24 cm d = 2 cm Vt = r2l = 75,4 cm3 Vg = k * Vt = 7,54 cm3 Vx max = Vt - Vg = 67,86 cm3 n = Vx max / 2 = 33,93 Katseandmed Fraktsiooni Elueerimismaht Optiline Lainepikkus number (ml) tihedus (A) (nm)
komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml kaupa fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga. Nb! Iga aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel max
· Täidise kõrgus ja kolonni sisediaameter: D=1,8cm , L=32,7 · Arvutatud täidise kogumaht Vt: Vt= r2 *L = 3,14*0,9*32,7= 83,21cm3 · Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vx max : Vg= K*Vt , Vmax =Vt-Vg Vg = 0,1 *83,21 =8,321 Vmax=83,21 -8,321 =74,89. · Arvutuslik fraktsioonide üldarv: n= Vmax/2 n=74,89/2 = 37,4 Siis fraktsiooni kogumisekd on vajalik umbes 37 katseklaasi!!! Mõõtmistulemuste tabel. Saannud andmete järgi koostame kromatogrammi 0 proov on eluaat mida me kogusime 100 ml mõõduklaasi. Selgitus kromatogrammi kohta. · Enne dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga eluaadi väljumist on väljunud umbes 20 ml eluaadi. · Elueeritud segus oli: 1) Dekstraansinine. Absorbeerib lainepikkusel 670 nm(sinie joon kromatogramil). Temal on sinine värvus ja ta väljub kolonnist esimesena, sest dekstraansinine on
peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit. · Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks. Fraktsioonide analüüsimine: · Mõõtsin kõikide fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Dekstraansinine: 670 nm Müoglobiin: 410 nm DNP-aspartaat: 360 nm · Eluaadi maht kolvis oli Vv=22,5 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
lasin sellel sisse imbuda. Siis kandsin geeli pinnale suurema kogus voolutuslahust, lisasin seda pidevalt vastavalt vajadusele. Avasin väljavoolu ning hakkasin koguma voolutit, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõudis kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni mahu mõõtsin pärast. Alustasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Elueerimise lõpetasin, kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrdusid 0-ga ja neid polnud vaja mõõta. Tulemused: · Kolonni täidiseks on Sephadex'i G-75, iseloomustav pundumistegur k on 0,1 · Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm · Täidise kogumaht Vt=L** =33* * =66,35 ml · Geelimaatriksi maht Vg = k · Vt=0,1*66,35=6,635 ml
2. Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. 3. Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklaasidesse. 4. Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine 1. Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. 2. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. 3. Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi
komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi värvust täheldada, värvusetute absorbtsiooni väärtused võib lugeda võrdseks nulliga. Iga aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel λmax
imbuda. Korratakse veel kord sama. · Kui proov on täielikult geeli imbunud kantakse geeli pinnale suurem hulk voolutit. · Kui esimene värviline riba on kolonnis lähenemas põhjale, eemaldatakse kolb ning hakatakse eluaadti koguma 2 ml mahu kaupa katseklaasidesse. · Kogu voolutamise vältel jälgitakse, et geeli kohal oleks piisavalt eluenti ja seda lisatakse vajadusel pidevalt juurde. · Elueerimise võib lõpetada, kui eluaat muutub värvituks ja eluaadi summaarne maht ei ole väiksem kui kolonni kogumaht. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule. Fraktsioonide analüüsimine · Aine kontsentratsiooni väljendatakse optilise tiheduse väärtusena, mis mõõdetakse vastaval lainepikkusel spektrofotomeetris. · Spektrofotomeetris mõõdetakse segude optilist tihedust järgmistel lainepikkustel:
· kui proov on sisestatud, avatakse väljavooluava ning lisatakse vähehaaval eluenti, kuni proov on täidisesse imbunud · pärast seda võib kolonni lisada juba suurema koguse eluenti · puhtasse kuiva kolbi hakatakse koguma ühendatud fraktsiooni · kui dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, eemaldatakse kolb ja hakatakse katseklaasidesse koguma fraktsioone 2 ml kaupa · elueerimise võib lõpetada, kui eluaat on muutunud värvituks Fraktsioonide analüüsimine: · aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel · absorptsiooni mõõdetakse spektrofotomeetril · värviliste segude puhu mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide
peale segu umbes 2 ml voolutuslahust ja kordasin protsessi seni kuni, olin veendunud, et proov on täielikult täidises. Lõpuks kandsin geeli pinnale suurema koguse voolutit. · Kui sinine riba (dekstraansinine) hakkas lähenema kolonni põhjale, eemaldasin ühendatud fraktsiooni kolvi kolonni alt ja alustasin 2 ml mahuga fraktsioonide kogumist katseklaasidesse. Elueerimise ja fraktsioonide kogumise lõpetasin kui eluaat muutus värvituks. · Fraktsioonide analüüsimine: · Mõõtsin kõikide fraktsioonide optilised tihedused, et teada saada ainete kontsentratsioonide mõõdud. Selleks kasutasin spektrofotomeetrit. Dekstraansinine: 670 nm Müoglobiin: 410 nm DNP-aspartaat: 360 nm · Eluaadi maht kolvis oli Vv=23 ml. Kuna fraktsioone koguti 2ml kaupa, siis iga järgmise fraktsiooni maht suureneb sellest 2ml võrra.
Elueerimislahus: 20 nM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,5 · Samal ajal jälgisin, kuidas liikus kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). · Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemaldasin kolonni alt kolbi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritd ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. · Elueerimise lõpetasin, kui eluaat muutub värvituks. Fraktsioonide analüüsimine. · Aine kontsentratsiooni väljendasin igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. · Absorptsiooni mõõdsin spektrofotomeetril. Katseandmete tabel. Lainepikkus, nm Fraktsiooni nr Elueerimismaht V, ml Optiline tihedus, A Ühendatud 29,0 0
Kvartstoru otsa ümber on mähis, läbi mille voolab vahelduvvool Läbi kvartstoru 3-kordsete seinte suunatakse argooni voog 1. Proov suunatakse plasmasse vesi-argoon aerosoolina 2. Kõrgel temp (6000-8000K)- proovis olevad ühendid atomiseeruvad 3. Aatomid ioniseeruvad ja hakkavad footoneid kiirgama 4. Emiteeritud valgus fokusseeritakse dispergeeriva elemendi abil (MK või polükromaator) Kromatograafia. Seletage mõisted ,,elueerimine", ,,eluent", ,,eluaat", ,,statsionaarne faas", ,,mobiilne faas" Elueerimine on protseduur, mille korral rakendatakse täidiskolonnis toimuvaid sorptsiooni ja desorptsiooni protsesse kasutades eluendi (gaas, vedelik) kolonni täidisest läbivoolutamist. Eesmärgiks võib olla ainete puhastamine või kuivatamine (adsorptsiooni- ja adsorptsiooni kolonnis), ainete segu lahutamine (kromatograafilises kolonnis) täidise regenereerimine.
nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht. Kuna minul oli kolonn ühendatud eluendi pudeliga, siis rohkem enam käsitsi ma eluenti kolonni kandma ei pidanud. Kolonnis tekkis kolm värvilist riba sinine, pruun ja kollane. Kui sinine riba jõudis kolonni alla äärde, siis eemaldasin ühendatud fraktsiooni kogumise jaoks mõeldud kolvi ning edasi kogusin eluaati juba 2 mL fraktsioonidena. Lõpetasin elueerimise kui eluaat oli pärast kollase riba kogumist muutunud uuesti värvituks ning ka eluaadi summaarne maht oli enam-vähem võrdne arvutatud kogumahuga Vt. Samuti vastas kogutud fraktsioonide üldarv varem väljaarvutatule, kui võtsin arvessse seejuures ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu. Ühendatud fraktsiooni mahuks oli: 26 mL Fraktsioonide analüüsimine Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni ehk
5 cm kõrgune vedelikukiht. Samas jägisin, kuidas liikus kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemladasin kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel jälgisin, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja lisasin seda vastavalt vajadusele juurde. Samuti vahetasin õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Fraktsioonide analüüsimine Et väljendada aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Absorbtsiooni mõõtsin spektromeetril. Mõõtmist alustasin kui olin saanud praktikumi juhendajalt loa.
molekulmass on dekstraansinisel st. 2·106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja DNP- aspartaadi mass on kõige väiksem. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti osa (nn ühendatud fraktsiooni) maht 23 cm3 Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu Fraktsioonide analüüsimine
(0,5-1 ml) eluenti 4. Lasen eluendil täidisesse imbuda. 5. Kordan seda protsessi väikeste kogustega seni, kuni kogu uuritav proov on kolonni sisenenud 6. Kannan geeli pinnale suurema hulga voolutit; moodustub 4-5 cm kõrgune vedeliku kiht. 7. Kui kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine) läheneb kolonni põhjale, siis jätkan eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena kaliibritud katseklaasidesse, kuni eluaat muutub värvituks ning kogu uuritav proov on läbinud kolonni. FRAKTSIOONIDE ANALÜÜSIMINE Antud töös kasutatakse fraktsioonide analüüsimisel spektrofotomeetrit. Sellega mõõdetakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Uuritavatele ainete iseloomulikud neeldumismaksimumid on: - Dekstraansinine 670 nm - müoglobiin 410 nm
molekulmass on dekstraansinisel st. 2·106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja aspartaami mass on kõige väiksem st 294,301. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti maht st Vv = 23 cm3. NB! See ei ole kolonni vaba maht, vaid nn ühendatud fraktsioon, mis moodustab vaid osa Vv- st! Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu
viia järjest väiksemaid osakesi. Diferentsiaalfuugimine – kaks või enam fuugimist erinevatel tingimustel. Gradientfuugimine – teostatakse sahharoosis või soolagradiendis. (Sedimentatsioonikoefitsent S = 10-13 sek. 2. Ioonvahetuskromatograagia, hüdrofoobsuskromatograafia,geelfiltratsioon-kromatograafia, afiinsuskromatograafia Kromatograafia on laboritehnika molekulide eraldamiseks. Eraldab molekule nt valke, mis on jaotunud mobiilse ja stratsionaalse faasi vahel. Eluaat on mobiilne faas, mis liigub mingis kindlas suunas. Eulaat, mis sisalad analüüsitavat ainet on eluent. Mobiilne faas võib olla gaas või vedelik. Eraldamine toimub valgu erinevaid omadusi kasutades: a) ioonvahetuskromatograagia- vastavalt valkude laengule b) hüdrofoobsuskromatograafia- vastavalt valkude hüdrofoobsusele c) geelfiltratsioon-kromatograafia-vastavalt valgumolekuli suurusele d) afiinsuskromatograafia-vastavalt valkude interaktsioonidele 3
saata kogumistopsi, vaid jääb kolonni filtri peale. Kolonni saagis minu DNA lõigule on vahemikus 70-90%) ja tsenrifugeerisime 30sek ja viskasin läbivoolatud puhver välja. 5. Lisasin 200µl pesupuhvrit ja jalle fuugisin 30 sek x2 korda, et olla kindel, DNA on puhas. 6. DNA elueerimiseks kasutasime MQ vett, mille pH oli > 6.0 (teisel juhul, DNA võib kahjustuda). Panin 10µl MQ vett peale ja fuugisin 1 min jooksul. DNA vabanes ränioksiidist ja sai kogumistopsiku sisse. 7. Kontrollin, kas eluaat sisaldab minu DNA lõiku, või puhastamise jooksul tekkisid vead: segasin kokku 1,8 µl DNA värvi, µl MQ H2O ja µl eluaati, ning panin jooksma kontrollgeelile (kokku on 10,8 µl). Kontrollgeeli pilt näitas õige bändi olemasolu, sellega
mistahes sobival meetodil. Valik kromatograafiaalaseid mõisteid · Adsorptsioon pinnanähtus, mille puhul aine molekulid kogunevad nõrkade van der Waalsi jõudude toimel tahke aine (adsorbendi) pinnale; vastupidine protsess on desorptsioon. · Eluent ehk vooluti lahusti või lahustite segu lahutatavate ainete proovi kolonnist läbivoolutamiseks. · Eluaat kolonnist väljuv vedelik, reeglina kogutakse fraktsioonidena. · Kromatograaf kompleksne seade, mida kasutatakse ainete segu kromatograafiliseks lahutamiseks koos tulemuste registreerimisega. · Kromatografeerimine ainete lahutamise protsess mingi kromatograafilise meetodi abil. · Kromatograafiline kolonn metallist, klaasist või kvartsklaasist kolonn, milles on liikumatu faas ja milles toimub segu komponentide lahutumine.
annaabi.ee 
