Immunoloogia praktikumi protokoll (0)

Tallinna Tehnikaülikool - Meditsiin - Meditsiin

1 Hindamata

Tallinna Tehnikaülikool
IMMUNOLOOGIA
Praktikum
Õppejõud:
Lilian Järvekülg
Õpilane:
YAGB41
Tallinn 2012
SDS-PAGE ELEKTROFOREES

Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist.
Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„ laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu.
Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud , vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD).

Töö käik:

Geeli valmistamine:
Lahutav geel (alumine geel ),
10%
Kontsentreeriv geel (ülemine geel) , 4%
Vesi
4,5 ml
3 ml
4x separating( stacking) buffer
2,5 ml
1,25 ml
40% acrylamide(AA)/bisacrylamide 37,5:1 (Bio-Rad)
2,5 ml
0,5 ml
APS
100 µl
100 µl
TEMED
10 µl
10 µl
Lõpp-maht
10ml
5 ml

Eeskirja järgi segame kõik komponendid kahe tuubi .
APS ja TEMED on katalüsaatorid, mis kiirendavad valgu tardumist.
Geeli valmistamisel paneme APS-i mõlemasse tuubi korraga, aga TEMED-i esialgu ainult alumise geeli tuubi (mille valmistame esimesena), sest lahused polümeriseeruvad väga kiiresti ja tarduvad.
Paneme kokku vajaliku aparatuuri ja lisame kahe klaasi vahele alumist geeli. Siis lisame natuke vett selleks ,et geel tarduks kõikides kohtades ühtlaselt. Kui alumine geel on tardunud valame vee välja, lisame ülemise geeli tuubi TEMED-it ja valame kahe klaasi vahele. Paneme kammi peale ja ootame , kuni geel tardub.
Kui geel on tardunud, võtame kammi ära ning saame kammi hammastesse oma proovid lisada. Lisame vanni Running puhvrit.
Kanname 10 µl proovi geelile, järjekorras:

Proov 1-kontrollproov

Proov 2-üleekspresseerunud valguga

Marker suuruse määramiseks

Proov 1

Proov 2

PSA kontsentratsiooni määramiseks 100 µg/µl

250 µg/µl

500 µg/µl

Teostame elektroforeesi tingimusel : 2 geeli 60mA, 45 min.

Geel
1 2 M 1 2 100 250 500 Geeli värvimine
Immunoblot
Ülemine osa
Alumine osa

Pärast elektroforeesi toimumist võtame geeli välja ja lõikame ülemise osa ära. Alumise osa lõikame markeri keskelt pooleks- väiksem osa läheb immunoblotti ja suurem osa värvimiseks.

Geeli värvimine

Suurema osa geeli värvime seguga : 25% isopropanool , 7% äädikhape, 0,1% Commasie Blue R.
Laseme seista üleöö.
Järgmisel päeval peseme 7% äädikhappega, kuni lilla värv on geelilt eemaldunud (valgud hoiavad värvi tugevamalt kinni kui geel).

Esimene marker on ära tulnud, seega loen algusest ühe juurde. Minu valgu suuruseks on umbkaudu 28 kD ja kontsentratsiooniks 150 µg/µl.
marker
Uuritav valk
Immunoblot (Western Blot)
Immunoblot on meetod, mis võimaldab uuritavas segus identifitseerida kindlat valku, eeldusel , et on olemas sellevastane antikeha , ning määrata tema molekulmassi.
Töö koosneb kolmest etapist:

Valkude lahutamine SDS-polüakrüülamiid geelektroforeesil.

Valkude ülekandmine membraanile.

Pärast elektroforeesi hoiame geeli bloti puhvris umbes 10 min.
Valkude ülekandmine geelist membraanile bloti aparaadis. Paneme bloti aparaadi anoodplaadi peale puhvris olnud filtri , membraani, geeli ja jälle filtri. Rullime kõik mullid välja ja paneme katoodplaadi peale.
Ülekanne toimub 15-25min, 10-15V.
Pärast ülekannet tuleb blokeerida membraani vaba osa, selleks asetame membraani 3% BSA , 0,05% TBS/ Tween -20 lahusesse (piimalahus) üheks tunniks.
Meie primaarse antikehaga ei sidunud, panime otse sekundaarse.
Peseme membraani 4x5 min TBS/Tweenis
Sekundaarse antikeha sidumine, inkubeerimine ja pesemine 2x TBS/Tween ja 1x TBS.

Membraani visualiseerimine.

Tõstame membraani kiledele ja kanname peale substraadi (SuperSignal West mõlemad komponendid 0,5ml) ja inkubeerime 5 min.
Visualiseerime membraani arvutis.

Tulemus näitab meile, et kogu meie valk on kondenseerunud ühte piirkonda ja katse oli sooritatud korrektselt.
Direct ELISA
Direct ELISA puhul sorbeeritakse antigeenid otse plastikule, seejärel seotakse antigeenile külge ensüümiga konjugeeritud antikehad . Immuunreaktsiooni tulemus visualiseeritakse ensüüm- substraat kompleksi värvusreaktsiooni abil ja hinnatakse kvalitatiivselt ja/ või kvantitatiivselt värvireaktsiooni intensiivsuse alusel mõõdetuna vastaval lainepikkusel.
Töö eesmärk: Kartuli viiruse X määramine.
Töö käik:

Meil on olemas ELISA plaat 16 süvenditega. Süvenditesse me kanname erinevate kontsentratsioonidega lehe proovid viirusega või viiruseta.

ELISA plaat
1
2
A
L-
L-
1:5
B
L-
L-
1:20
C
L-
L-
1:50
D
L-
L-
1:100
E
L+
L+
1:5
F
L+
L+
1:20
G
L+
L+
1:50
H
L+
L+
1:100

Igasse süvendisse kanname 100µl proovi.
Taimelehest eraldame mahla spetsiaalse mahlapressi abil, tsentrifuugime ja eppendorftuubis lahjendame selle vajaliku kontsentratsioonini PBS-ga. L- terve leht, L+ nakatunud.
Kanname kõik proovid vastavatesse süvenditesse ja jätame seisma üleöö 4 kraadi juurde.
Plaadilt eemaldame mitteseostunud antigeeni ja peseme plaate 4x PBS/ Tw-ga ja 1x PBS- ga shakeril.
Plaadi blokeerime 1% BSA lahusega PBS/ Tw-s 1h toatemperatuuril, eemaldame blokeeriva lahuse ja peseme 3x PBS/Tw-ga.
Plaadile kanname ensüümiga konjugeeritud antikeha, lahjendus 1:500. Inkubeerime 1.5 tundi 37 kraadi juures. Konjugaadi eemaldame ja peseme 4x PBS/Tw-ga ja 1x PBS-ga.
Valmistame peroksüdaasi substraadi lahuse ja ensüümreaktsiooni katalüsaatori kanname süvenditesse . Värvusreaktsiooni mõõdetakse lainepikkusel ƛ450.

Töö tulemus:
ELISA plaat
1
2
A
0,2106
0,2289
1:5
B
0,2344
0,2027
1:20
C
0,5148
0,5256
1:50
D
0,0619
0,0636
1:100
E
0, 3011
0,2881
1:5
F
0,4783
0,4817
1:20
G
0, 5606
0,4472
1:50
H
0,1389
0,1845
1:100
Katse tulemus näitab ,et plaati süvendites on olemas kartuli X viirus .

.DOCX Laadi alla originaalfail 5 lk · .docx · 32 allalaadimist

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 5 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2013-06-02 Kuupäev, millal dokument üles laeti

32 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

heleenike246 Õppematerjali autor

Immunoloogia praksis läbisime teemad Elisa, SDS-Page elektroforees ja Immunoblot. Protokoll sai esimese korraga arvetsatud.

immunoloogia praktikum protokoll geel antikeha temed

Sarnased õppematerjalid

docx

Immunoloogia praktikumi protokoll

Tallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES  Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist.  Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu

Immunoloogia i

docx

Immunoloogia praktikumi protokoll

Tallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB-42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab

Immunoloogia i

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

seda on väga palju. Milline aine ja kuidas seob kolonnis DNA-d? Milline elueerimispuhvri omadus aitab DNA kolonnist välja elueerida? Kolonnis olev ränioksiin seob DNA, nii, et DNA seob fosfaatselgroogupidi ränioksiidiga. (seondumisele aitab kaasa, eelnev ADB puhver). Elueerimispuhvri omadustest on kõige olulisemad madal soolasisaldus ja aluseline pH. Millist olulist infot saan kolonnide kohta firma kodulehelt? Kas kasutatud kit sobis antud praktikumi töö teostamiseks, millest seda järeldada? Aeg 15 minutit Vajatav varustus Tsentrifuug DNA suurus 50bp kuni 23kb Sobivad proovid DNA TAE/TBE puhvriga agaroosgeelist DNA puhtus Kõrge kvaliteedi, puhtusega DNA, mis on sobilik sekveneerimiseks,

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Praktiline töö - SDS-PAGE PROTEOOMIKA

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL MATEMAATIKA-LOODUSTEADUSKOND Geenitehnoloogia instutuut Praktiline töö nr. 2 SDS-PAGE Protokoll Koostaja: XXXXXX Juhendajad: Katrina Laks, Merlin Friedemann Tallinn, 2015.a Teoreetiline osa. Elektroforees on makromolekulide eraldamine elektrivälja toimel. SDS-PAGE (naatrium- dodetsüül sulfaat polüakrüülamiid geel elektroforees) on laialdaselt kasutatav valkude elektroforeetilise eraldamise meetod, kus valkude denatureerimiseks kasutatakse SDS-i.

Genoomika ja proteoomika

docx

Molekulaar- ja rakubioloogia

Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne YAGB41 Kevad 2014 Vlada Šiposa Molekulaarbioloogia praktikumi aruanne 1. Praktikum – pipepteerimine. Töötasime erineva suuruse pipettiga: 1000, 200, 20 ning 10 µl. Igale pipettile sobib oma suurusega otsik. Otsikud on steriilsed ja neid ei tohi neid näpuga katsuda. Pärast kasutamist tuleb otsikud ära visata spetsiaalsele konteinerisse. Otsik peab istuma tihkelt, kuna kui istub liiga lõdvelt, siis sissetõmbav kogus on tegelikult vähem, kui oodetud (tõmmatakse sisse ka õhk)

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaar- ja rakubioloogia

Tallinna Tehnikaülikool Matemaatika-Loodusteaduskond Geenitehnoloogia Instituut Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum Aruanne Koostanud: Luise Tiks YASB61 112332 Tallinn 2014 Pipeteerimine Harjutus 1 1 ml pipetti kasutades pipeteerisin 15-ml falconisse 1,65 ml detergenti, 3,85 ml vett (kokku 5,5 ml 30% lahust). Detergendi pipeteerimiseks kasutasin pahupidi tehnikat.

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

docx

Molekulaarbioloogia protokoll

Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi: Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin metüleeritakse (replikatsioonijärgselt aitab eristada värskelt sünteesitud DNA ahelat vanast ahelast). Ekspresseeruvate geenide promootorpiirkondi ei metüleerita. Metüleeritud tsütosiin allub kergesti spontaansele de

Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum

doc

Molekulaarbioloogia praktikumi protokoll

Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2013 a) Nimi: YAGB41 Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal. Mujal genoomi piirkondades on CpG dinukleotiidi vähe, sest sellise dinukleotiidi tsütosiin metüleeritakse (replikatsioonijärgselt aitab eristada värskelt sünteesitud DNA ahelat vanast ahelast).

Molekulaarbioloogia

Rohkem sarnaseid