• Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga seondumata antikeha eemaldamiseks Inkubatsioon sekundaarse antikehaga, selleks on vaja: Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (400 μl): • 40 μl 2% BSA lahust • 60 μl 1x PBS-Tweeni • Goat anti mouse 1:2000 Alexa568 (punane värv) 0,2 μl • Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. Sekundaarse antikeha valikul tuleb jälgida, millises loomas on tehtud primaarne antikeha. Sobiv fluorokroom tuleb valida selle järgi, milliseid teisi fluorokroome veel samal preparaadil kasutate. Praktikas kasutatakse korraga tavaliselt 2-3 antikeha, on võimalik ka rohkem. Fluorokroomid on üldiselt tundlikud valguse suhtes, sellepärast on vajalik ka neid liigse valguse eest kaitsta. • Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga • Pesta 1 kord 1 ml MQga Alusklaasidele panemine ehk sulundamine, selleks on vaja:
primaarsed antikehad (mouse anti tubuliini). Need on konjugeeritud punase Alexa546 fluorokroomiga. d. Kasutasime sinist, punast ja rohelist fluorokroomi. Sinine oli DNA värv DAPI, mille ergastamiseks on vaja lainepikkust ~360 nm, kui värv on seostunud kahe-ahelalise DNA-ga, ja 341 nm (jääb UV kiirguse ja lilla valguse piiri peale), kui värv pole DNA-ga seostunud, ning kiirgab valgust lainepikkusega 450-460 nm. Punane oli sekundaarse antikehaga kojungeeritud fluorokroom Alexa546, mille ergastamiseks on vaja valgust lainepikkusega 546 nm (roheline valgus) ning kiirgab valgust lainepikkusega ~600, mis on oranzikas-punast värvi. Roheline oli EGFP enhanced green fluorescent protein, mida kodeeriv järjestus sisaldus kasutatud vektoris. Ergastamiseks on vajalik valgus lainepikkusega ~488 nm (sinine valgus) ning emiteeritava valguse lainepikkus on ~520 nm, mis on roheline. e
katteklaasile lisada tilk immersiooniõli. 161. Vaatlesime rakke rohelises, punases ja sinises kanaalis. 162. 163. 1. pilt: pEGFP/FoxO3a-ga transfekteerunud rakud. Roheline – FoxO3 liitvalk, mis asub tsütoplasmas. On näha ka tuumad. 2. pilt: Mouse anti tubuliin ja goat anti Mouse Alexa568-ga värvitud rakud. On näha mikrotuubuleid. Punane – sekundaarse antikeha küljes olev fluorokroom Alexa568. Number 568 näitab lainepikkust nmeetrites (absorb 578 nm ja emit 603 nm) 3. pilt: Tripleband filtriga tehtud pilt. Sinine – fluorestseeruv värv DAPI, mis värvib DNAd. On näha tuumad. Neeldumismaximum 461 nm juures. 164. FoxO3a ise kuulub transkriptsioonifaktorite perekonda. Sellise valgu funktsioonideks on apoptoosi reguleerimine ning kaitsmine oksüdatiivsest stressist reguleerides antioksüdante. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175.
metaboolsete mürkide kasutamisel. Tulemusena kuhjub tsütokiin endoplasmaatilisse retiikulumi, vesiikulivõrgustikku. Kui järgnevalt rakud fikseerida, kindlustamaks valkude säilumine järgneval töötlemisel, ning pehmete detergentidega antikehadele läbitavaks muuta, saavad antikehad võimaluse tungida rakusiseste ruumideni (kompartmentideni) ning ära tuntu märgistada. Antikehad on eelnevalt fluorokroom-märgistatud. T-rakke samaaegselt teiste märgistega märkides, saab näiteks leida IL-10 tootvate CD25+ CD4 T-rakkude sageduse. Meetodi puuduseks on see, et uuritavad rakud tapetakse. Tsütokiinide vangistamine on meetod, mis kasutab hübriidantikehi, milles on seotud kaks erinevat kergete ja raskete ahelate paari erinevatest antikehadest. Saadud antikehal on seega kaks antigeeni siduvat saiti erinevate ligandide jaoks
annaabi.ee 
