RASKEMETALLIDE MÄÄRAMINE AHVENAS (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Matemaatika-loodusteaduskond
Analüütilise keemia õppetool
RASKEMETALLIDE MÄÄRAMINE AHVENAS
Magistritöö
Kristiina Fuchs
Juhendaja : teadur Ph.D – Anu Viitak
Konsultandid: MSc – Leili Järv
Bioloogiakandidaat Mart Simm
Tartu Ülikool Eesti Mereinstituut
Tallinn 2009

Sisukord

Sisukord 2
1. SISSEJUHATUS 4
2. Kirjanduse ülevaade 5
2.1 Raskemetallid 5
2.1.1 Plii ( Pb) 5
2.1.2Kaadmium (Cd) 6
2.1.3Vask (Cu) 7
2.1.4Tsink (Zn) 8
2.1.5Elavhõbe 8
2.2 Pärnu laht 10
2.3 Helsingi komisjon ( HELCOM ) 11
3. Materjal ja metoodika 12
3.1. Bioloogiline materjal, Ahven 12
3.2. Bioloogilise materjali ettevalmistamise meetodid 14
4. Analüüsi meetod 15
4.1 Aatomabsorptsioon -spektraalanalüüs (AAS) 15
4.2 Leek - AAS 16
4.3 Segajad 17
4.3.1 Grafiit -AAS määramisel 17
4.4 Avastamispiir (ka detekteerimispiir),(LoD) 19
4.5 Määramispiir (ka kvantitseerimispiir), (LoQ) 19
4.6 Lineaarne ala 20
4.7 Tõesus 20
4.8 Täpsus 20
4.9 Mõõtemääramatus 22
4.10 Saagis 24
5. Eksperimentaalne osa 25
5.1Cu ja Zn sisalduse määramine Leek-AAS meetodil 25
Reaktiivid 25
Seadmed ja vahendid 25
5.2 AAS külmauru meetod Hg määramiseks 26
Reaktiivid 26
Seadmed ja vahendid 26
5.3 Pb ja Cd sisalduse määramine elektrotermilise 27
aatomabsorptsioon spektrofotomeetrilisel (ETAAS) meetodil 27
Seadmed ja vahendid 27
5.4 Proovide eeltöötlus 29
5.5 Elementide mõõteparameetrid 30
5.5.1 Vask (Cu) 30
5.5.2 Tsink (Zn) 30
5.5.3 Plii (Pb) 31
5.5.4 Kaadmium (cd) 31
5.5.5 Elavhõbe (Hg) 32
6. Andmete statistiline analüüs. 33
33
7. Tulemused 34
7.1 Elavhõbe (Hg) 35
7.2 Metallide sisaldus ahvenas sõltuvalt vanusest 36
7.3 Metallides sisaldus ahvenas sõltuvalt soost 38
7.4 Metallide sisaldus ahvenas sõltuvalt pikkusest 40
8. Arutelu 42
8.1 Vask (Cu) 42
8.2 Tsink (Zn) 42
8.3 Plii (Pb) 43
8.4 Kaadmium (Cd) 43
8.5 Elavhõbe (Hg) 43
Kokkuvõte 44
Summary 46
Kasutatud kirjandus 47
LISA 1 49
LISA 2 49
LISA 3 51
LISA 4 51

1. SISSEJUHATUS

Loodusliku keskkonna saastatus (reostatus), on reeglina tingitud inimtegevusest – tootmisest ja tarbimisest, inimese poolt looduskeskkonnast võetud ja ärakasutatud ainete ja materjalide muundumisest tema tegevuse käigus ja nende sattumisest (paiskamisest) tagasi keskkonda. Kõik, mis võetakse loodusest, jõuab lõpuks sinna ka tagasi. Selle tagajärjel hakkavad inimkonna tegevus ja toodetud saast mõjustama ülimalt keerukaid looduslikke protsesse ja rikkuma nende senist tasakaalu.
Eesti veeseaduse (1994) tähenduses on ohtlik aine element või ühend, mis mürgisuse, püsivuse või bioakumulatsiooni tõttu põhjustab või võib põhjustada ohtu inimese tervisele ning kahjustab või võib kahjustada teisi eluorganisme või ökosüsteeme.
Inimesed on tootnud üle saja tuhande erineva kemikaali, s.t. aine, mida looduses ei esine. Enamuse kemikaalide kohta pole meil informatsiooni, kuidas nad looduskeskkonnas liiguvad: kogunevad, hajuvad või kuidas ja kas nad mõjuvad elusorganismide , s.h. inimese, tervisele. Suurem enamus, umbes ¾, ohtlike ainete mõjust, ei avaldu kohe loodusesse sattumise järel, vaid alles mingi aja pärast. Sellist nähtust nimetatakse „aegpommi efektiks“. Sellest teadmusest johtuvalt on paljud, vanemate meetoditega määratud ja mittekahjulikeks tunnistatud ained, nüüdseks ohtlikeks tunnistatud.
Eesti kontrollib oma looduskeskkonnas: organismides, vees ja setetes, püsivate orgaaniliste saasteainete sisaldust. Ohtlike ainete ruumilis -ajaliste muutuste hindamiseks Eestit ümbritseval merealal kasutatakse rahvusvahelise HELCOM COMBINE programmis ette nähtud bioindikatsiooni meetodit
Tabel:1 Keskkonnaseire käigus kalades määratavad ohtlikud ained
Raskemetallid
CAS nr
EINECS nr
Elavhõbe (Hg)
7439-97-6
231-106-7
Kaadmium (Cd)
7440-43-9
231-152-8
Plii (Pb)
7439-92-1
231-100-4
Vask (Cu)
7440-50-8
231-159-6
Tsink (Zn)
7440-66-6
215-259-7
Magistritöö eesmärgiks oli määrata raskemetallid (Pb,Cd,Cu,Zn ja Hg) ahvena lihases ja maksas ning välja selgitada nende ladestumise ja kogunemise seaduspärasusi kalades.
Bioloogiline materjal koguti kahel järjestikusel aastal: 2006. ja 2007., Pärnu lahest.

2. Kirjanduse ülevaade

2.1 Raskemetallid

2.1.1 Plii ( Pb)

CAS nr. (7439-92-1) Plii on kohustuslikuks (mandatory) ohtlikuks aineks, mille määramine ja tulemuste esitamine on ette nähtud HELCOM konventsiooni raames. Eestis on plii ja selle ühendid kantud ohtlike ainete esimesse nimekirja /7/ Kalatoodetes (värske kala: jahutatud, külmutatud; kalahakkliha , kalafilee; teiste mereloomade liha) ning kalamaksas ja sellest valmistatud toodetes on plii piirnormiks 1,0 mg kg-1, meresaadustes ( molluskid , vähilaadsed jt.) aga 10,0 mg kg-1. Pliid esineb kõikjal keskkonnas. Pliid tekib palju ka inimtegevuse käigus, nagu orgaaniliste kütuste põletamisel, kaevandamisel ja tööstuses. Looduses esineb pliid lubjakivis ja galeniidis (PbS). Plii võib olla lahustuvana ioonidena või mittelahustuvana sulfiidina, karbonaadina või sulfaadina. Ekspositsioon tekib õhu, toidu ja vee kaudu. Pliid on põhjavees harva. Joogivette satub plii pliid sisaldavate veetorude kaudu; Kuna plii on püsiv, paiknedes kõrgeimas kontsentratsioonis 1-5 cm sügavuses pinnases (sõidutee äärne tolm), tuleb tema kahjutustamiseks kasutada meetmeid. 80% päevasest pliikogusest satub inimese organismi toidu, mustuse ja tolmu kaudu. Kui pliiühendid paiskuvad õhku, võivad nad lennata kaugele.
Nagu elavhõbe ja kaadmium, on ka plii keemiline element, mille bioloogilist kasutusotstarvet pole teada. Aine on mürgine ka väikestes kogustes . Keemispunkt on kõrge ja aururõhk väike, seega tekib keskkonnaprobleem (erinevalt elavhõbedast) alles ioniseerunud aine puhul. Pliisisalduse kasvu Läänemeres on jälgitud sete põhjal, kusjuures on täheldatud, et pliisisaldus on suurenenud vastavalt industrialiseerumise levikule Kesk-Euroopast põhja suunas. Aine kandumist veekogudesse ja selle kontsentratsiooni piirab pliiühendite vähene lahustuvus . Metalli kujul esinev plii oksüdeerub hapniku mõjul lahustuvaks iooniks happelistes oludes. Koos jõesetetega kandub vastuvõtvatesse veekogudesse pliid, kuid see element settib kiiresti näiteks karbonaadina PbCO3. Happelistes oludes nii plii sulfiidide kui ka karbonaatide lahustuvus kasvab. Happelisuse suurenemise tõttu tõuseb plii lahustuvus, ja pinnasest satub vette rohkem pliid ning seega võib graniitaluspinnaga aladel tekkiv happelisuse suurenemine esile kutsuda plii lahustumist. /33/

Kaadmium (Cd)

CAS nr. (7440-43-9) Kaadmium on Eestis kantud veekeskkonnale ohtlike ainete nimistusse üks /7/. Mereorganismides on kaadmiumi määramine ette nähtud nii HELCOM COMBINE programmis /4/ kui ka Eesti Riikliku keskkonnaseire allprogrammis ; Ohtlike ainete seire rannikumeres ;. EMÜ standard merevees /5/ on aasta keskmisena estuaari ja rannikuvetes 0,5 g l-1 (lahustunud kaadmium) või 1,0 g l-1 ( summaarne kaadmium). Kalatoodetes (värske kala: jahutatud, külmutatud; kalahakkliha, kalafilee; teiste mereloomade liha) on kaadmiumi piirnormiks 0,2 mg kg-1, kalamaksas ja sellest valmistatud toodetes 0,7 mg kg-1 ja meresaadustes (molluskid, vähilaadsed jt.) 2,0 mg kg-1 ./6/
Kaadmiumil ei ole teadaolevalt organismis mingit kasutusotstarvet. Kaadmiumi mürgisus võib osaliselt seonduda sellega, et aine kuulub elementide perioodilisuse tabelis samasse rühma nagu tsink, mis võib organisme eksitada nagu oleks tegemist kasuliku elemendiga. Ka mineraalides esineb kaadmium sageli koos tsingiga, seetõttu on kaadmium sattunud loodusse enamasti just tsingi tootmise käigus. Praegusel ajal kasutatakse kaadmiumi muu hulgas värvainetes (kaadmiumsulfiid on värvuselt kollast tooni) ja elektroonikas. Merekeskkonnas esineb kaadmium peamiselt lahustunud ioonidena või kloriidikompleksina, välja arvatud hapnikuvabad süvaveed, kus sulfiid muudab kaadmiumi kiiresti setteks.
Kaadmium on üks kõige ohtlikumaid raskemetalle ja tema uurimine keskkonnas, sealhulgas Läänemeres on üheks prioriteediks keskkonnakaitses./33/

Vask (Cu)

CAS nr. (7440-50-8) Vask on kantud veekeskkonnale ohtlike ainete nimistusse kaks kui Läänemere piirkonna merekeskkonna kaitse konventsiooniga reguleeritud ohtlik aine /7/. Mereorganismides on vase määramine ette nähtud nii HELCOM COMBINE programmis kui ka Eesti Riikliku keskkonnaseire allprogrammis EMÜ standard vasele merevees puudub. Kalatoodetes ja kalade maksas on vase piirnormiks 10,0 mg kg-1, meresaadustes (molluskid, vähilaadsed jt.) 30,0 mg kg-1 /6/
Vask kuulub mitme elutähtsa ensüümi koostisse ja on mikroelemendina seetõttu vajalik.
Looduses vabaneb seda pinnase mineraliseerumisel, vulkaanipursetel ja taimestikust.
Kohati võib pinnase vasesisaldus ulatuda väga kõrgele, ning leidub taimi, mis on
niisugustele muldadele kohastunud ja mida saab kasutada vaseindikaatoritena.
Inimtegevusega vabaneb vaske siiski looduslikust märksa enam, aastas 260 000 tonni, s.o
93% "lahtipääsevast" vasest. Üle poole vasesaastest tuleb metallurgiast ja puidu
põletamisest. Vask on loomadele, eriti veeloomadele väga mürgine (kalade jaoks toksilisim metall elavhõbeda järel). Kõige mürgisemad on Cu2+, CuOH + ja Cu2OH2 2+
- ioonid . Et vase (aga ka tsingi, nikli jmt metallide) mürgiste ioonide sagedust (sidumist) mõjutavad teised veesleiduvad ühendid, siis on need metallid eriti ohtlikud pehmeveelistes magevetes.
Nagu paljude metallide puhul, on ohustatuimad noorloomad ning liikide vahel on
tundlikkuses suuri erinevusi ( kaladel umbes 30kordseid). Analoogselt pliiga on eelneva
"vasekogemusega" loomad sageli ka hiljem kõrgenenud tundlikkusega.
Vasemürgistusega kaasnevad kudede, eriti neeru- ja maksakahjustused, lämbumine, sest
väheneb vere hapnikusidumisvõime (kaladel); närvikahjustused ja muutused käitumises,
näiteks orientatsioonivõimes ja temperatuurieelistustes; sigivuse langus. /1/2/3/20/

Tsink (Zn)

CAS nr. (7440-66-6) Tsink on kantud veekeskkonnale ohtlike ainete nimistusse kaks kui Läänemere piirkonna merekeskkonna kaitse konventsiooniga reguleeritud ohtlik aine .
EMÜ standard tsingile merevees puudub. Kalatoodetes (värske kala: jahutatud, külmutatud; kalahakkliha, kalafilee; teiste mereloomade liha) on tsingi piirnormiks 40,0 mg kg-1, meresaadustes (molluskid, vähilaadsed jt.) 200 mg kg-1 /6/7/

Elavhõbe

CAS nr. (7439-97-6) Elavhõbe on üheks kohustuslikuks (mandatory) ohtlikuks aineks, mille seire ja tulemuste esitamine on ette nähtud HELCOM konventsiooni raames. Eestis on elavhõbe kantud ohtlike ainete esimesse nimistusse /7/. EMÜ standard elavhõbedale on estuaari ja rannikuvetes 0,3 mg/l-1. Eestis on kalatoodetes (värske kala: jahutatud, külmutatud; kalahakkliha, kalafilee; teiste mereloomade liha) ning kalamaksas ja sellest valmistatud toodetes elavhõbeda piirnormiks 0,5 mg kg-1, meresaadustes (molluskid, vähilaadsed jt.) aga 0,2 mg kg-1 . Riikliku Keskkonnaseire raames on elavhõbeda sisaldust mereorganismides määratud alates aastast 1998. /6/8/
Elavhõbe on elektronide paigutuse poolest tsingi ja kaadmiumi sugulaselement, kuid elavhõbeda aatomisisene elektronide ehitus on neist siiski erinev. Metalli kujul olev elavhõbe on vedelikutaoline ja kergesti aurustuv, ning väga mürgine. Merekeskkonnas esineb elavhõbe peamiselt lahustunud ioonidena, kuid adsorbeerub tugevasti merevee orgaanilises peenagregaadis ning settib. Elavhõbe moodustab koos klooriioonidega polükloriidi (HgCl4^[2-], HgCl^[3-]), lisaks sellele moodustab element ka hüdroksiidikomplekse. Elavhõbedasisaldus merevees on siiski väga väike. Hapnikuvabas keskkonnas settib elavhõbe sulfiidina. Elavhõbeda mürgine mõju on väga ohtlik eelkõige seepärast, et element moodustab keskkonnas metüülelavhõbeda CH3Hg ^[+] või dimetüülelavhõbeda (CH3)2Hg. Reaktsiooni vahendavad mikroorganismid ja see toimub peamiselt hapnikuvabas keskkonnas. Metüülelavhõbedal on kõrge aururõhk (keemistemperatuur on 94°C)), seega aine aurustub kergesti. Lisaks sellele on metüülelavhõbe ka rasvades lahustuv, mistõttu võib aine rikastuda orgaanilisse materjali kergemini kui teised mürgised metallid, ja ladestuda sel viisil kiiresti organismide kudedesse kuni mürgiste koguste tekkimiseni. Aine ei ladestu siiski üksnes organismi rasvkoesse nagu orgaanilised klooriühendid, vaid seondub ka proteiinidega. /38/
Veest omastab organism elavhõbedat metüülelavhõbeda kujul. Metüülelavhõbe kahjustab närvisüsteemi, eelkõige suuraju koort, pärssides rakkudes valgusünteesi, tagajärjeks on rakkude hukkumine ja närvikoe kärbumine. Elavhõbeda puhul tuleb juttu teha bioakumulatsioonist. See tähendab püsivate ainete, mida organism ei lagunda ega väljuta, kogunemist elusorganismidesse. On ilmne, et niisuguste ainete kontsentratsioon elusorganismides kasvab järsult toiduahela piires. samuti loomade vananedes .
Elavhõbe on tugevasti akumuleeruv. Näiteks merevees, milles Hg foon on alla 0,1 ppb (ppb=parts per billion – miljardik osa) võib kalade koes kontsentratsioon ületada 0,5 ppm (ppm – miljondik osa). Sellise kala söömine pole tervisele kasulik! Mõned kalad ja kalatoidulised loomad on siiski võimelised metüülelavhõbedat demetüleerima, vähendades niiviisi selle (ja enese) mürgisust. Seepärast on metüülelavhõbeda kontsentratsioon nende loomade maksas alati palju kõrgem kui mujal organismis. Kõige olulisemat elavhõbedareostust on läbi aegade tekitanud elavhõbeda kasutamine pestitsiidina. /9/10/11/12/13/31/32/33/

2.2 Pärnu laht

Pärnu laht on Eesti edelaosas paiknev laht, mis on tuulte ja tormide eest kaitstud saarte ja/või mandriga nii läänest, põhjast kui idast joon 1). Pärnu lahe pindala on 10565 km2. Pärnu laht on väga madal, selle suurim sügavus on 11 m, lahesuus. Keskosas on see 7 m /21/. Lahe pikkus on üle 20 kilomeetrit. Liunina ja Pikanina vaheline lahesuu on 12 km lai. Pärnu lahte voolab sisse Pärnu jõgi, mille keskmine aastane vooluhulk on 1,6 km3, mis on ligi 80% kogu lahe kubatuurist. See hoiab lahe vee soolsuse suhteliselt madala: 4 - 5 ‰. Keskmine kinnisjää kestus on 60 päeva , külmadel talvedel võib jääkatte kestvus olla kuni 120 päeva. /15/
Suvised keskmised veetemperatuurid on rannalähedastes veekihtides 190 - 220 C, kõrgeimad näitajad ulatuvad kuni 26 0C /21/. Kõrge veeseisu ja tugevate põhjakaare tuulte mõjul pinnakihtide temperatuur langeb. /14/15/
Joonis 1 Pärnu laht

2.3 Helsingi komisjon (HELCOM)

Helsingi komisjon ehk Läänemere (mere) keskkonnakaitse komisjon (HELCOM) on valitsustevaheline organ, mis ühendab kõiki üheksat Läänemereriiki (Taani, Eesti, Soome, Saksamaa, Läti, Leedu, Poola, Venemaa, Rootsi) ja Euroopa Liitu.
Joonis: 2 HELCOM riigid
HELCOM on Helsingi konventsiooni ehk Läänemere piirkonna merekeskkonna kaitse konventsiooni juhtorgan. HELCOMi eesmärgiks on töötada välja riikide ühist poliitikat Läänemere kaitseks, vahetada keskkonna-alast informatsiooni, töötada välja soovitusi mere olukorra parandamiseks ning teostada järelvalvet vastu võetud keskkonnastandardite elluviimise üle liikmesriikides. Üks tegevustest on ka ohtlike ainete seire Läänemeres.

3. Materjal ja metoodika

3.1. Bioloogiline materjal, Ahven

Ahven (Perca fluviatilis L) on luukalade klassi kuuluva pärisluuste alamklassi kuuluva ahvenlaste seltsi kõige laialdasemalt levinud liik. Ahvena levila (areaal) on väga suur ulatudes läänes Briti saartest kuni idas Kolõmani. Euroopas puudub ahven vaid Pürenee ja Apenniini poolsaartel ja Skandinaavia põhjaosas. Ahven on meie vete üheks enamlevinud liigiks , seda nii mage kui merevees. Meres eelistab ahven hästi läbisoojenevaid merealasid /16/, mis on kaitstud otsese tuule mõju eest . seetõttu leidub ahvenat rohkelt Eesti lääne- ja edelarannikul (geograafiliselt hästi liigendatud ala), s.o. väinameres ja Pärnu lahes. Eesti tähtsamaks ahvenapüügi piirkonnaks on Pärnu laht. Siit püütakse kuni 65% vabariigi ahvenasaagist. Ahvenale soodsalt madala soolsuse (0-5,5%) /34/, tagab Pärnu lahes rohke mageda vee sissevool jõgedest, eelkõige Pärnu jõest. /18/Ahven elab meie tingimustes vabaduses üle 10a vanaks . Ahvena toitumine on kõige intensiivsem 12 – 20 °C veetemperatuuri juures, s.o. maist oktoobrini. /17/
Ahvenat peetakse suhteliselt paigalise eluviisiga kalaks, kes on vajadus korral võimeline ette võtma ka suhteliselt pikki ja kiireid rändeid. Tänu laiale ökoloogilisele amplituudile asustab ahven vee-kogudes peaaegu kõiki biotoope: merest kuini rabajärvedeni välja. Ahven moodustab lokaalpopulatsioone, s.t. tema aktiivne migratsioon on 15-20 km raadiuses, s.t. tema abil saab anda hinnanguid suhteliselt kitsaste merealade seisundi kohta. See ka põhjus miks valisin uurimisobjektiks ahvena. /29/31/

• Ahven on ilusa ja ereda värvusega kala. (joonis 3)
  

• Värvus sõltub veekogust.
  
• Tal on tumeroheline selg, rohekaskollased küljed ning punased uimed .
  
• Kala suurus oleneb tema vanusest. Pikkus tavaliselt 5...25 cm ja kehamass 20...180 grammi ulatuses. Viie-kuueaastased ja vanemad ahvenad on põhimõtteliselt erakliku eluviisiga ning kogunevad parvedesse veel üksnes kudeperioodil. Vanemad ja suuremad ahvenad hoiduvad enamasti sügavamatesse veekogu osadesse
  
• Tänu suurele arvukusele ja laialdasele levimisele on nad heaks toiduobjektiks paljudele kaladele ja merelindudele.
  

Pärnu lahes – koha, ahvena ning vimma varude olukord intensiivse püügi tõttu halvenenud tugevad põlvkonnad püütakse välja 1-2 aastaga
olukorra parandamiseks tuleb vähendada kalastussuremust ning tõhustada kontrolli, takistada alamõõdulise kala püüki. /35/
Ahvena bioloogiline materjal koguti 2006-2007.a. kevad/sügis Pärnu lahes (Liivilaht).
Joonis:3. Ahven

3.2. Bioloogilise materjali ettevalmistamise meetodid

Proovide bioloogilise analüüsi käigus on määratud analüüsitavate bioloogiliste objektide/ bioindikaatorite:

täispikkus: TL, sentimeetrites (ninamikust sabauime lõpuni)

individuaalne kehamass: TW, grammides

sugu: F-emane; M- isane ; JUV-juveniil (noorvorm, kellel palja silmaga pole sugu võimalik määrata), FM-sugu määramata

kuuepallilise skaala järgi suguküpsusaste: I – VI, järgi – I,II (mittesuguküps); VI (vahetult pärast kudemist); II-V (küpsemine-st. eriti intensiivne toitumine ja akumuleerumine)
vanuse määramiseks eemaldati ahvenatel lõpuskaaneluu (operculum) (kummagi silma taga paikneb lõpuseid kattev lõpusekaas)

Lõpuskaaneluud puhastati pehmetest kudedest keevas vees leotades, misjärel eemaldati denatureerunud valguline mass luudelt.

vanuse määramiseks kasutati DataMATE 895A, millel on 8 – 12-kordne suurendusvõime
Bioloogilised parameetrid on esitatud lisas (Lisa 1).
Kui algselt nähti HELCOM programmis ette ohtlike ainete määramine kalade lihastes, siis üsna peagi selgus, et näiteks raskemetallide kontsentratsioon lihastes on reeglina allpool avastamispiiri. Tulemusena muudeti metoodikat ja raskemetalle hakati ka määrama kalade maksas./4/
Raskemetallisisaldust määrati kala lihastest ja maksast. Lihaskoe kättesaamiseks kala kõigepealt roogiti: eemaldati pea, uimed ja sisused. Seejärel eraldati sisustest maks. Järgnevalt kala fileeriti, s.t. eraldati nn. söödav osa – lihased, nahast. Lihasmass puhastati luudest ja uimede basaalkehadest.
Ühe keemilise analüüsi jaoks kulub 20 g kalaliha ja 10g maksa, mis tähendas, et nooremate/väiksemate kalade puhul tegime nn. keskmise proovi (pool sampling). Vanematel/suurematel ahvenatel saime teha individuaalse proovi. Vahetult peale bioloogilise materjali eraldamist, proovid sügavkülmutati – 260C juures.

4. Analüüsi meetod

4.1 Aatomabsorptsioon-spektraalanalüüs (AAS)

Analüüsimeetodina on antud magistritöös kasutatud aatomabsorptsioon-spektraalanalüüsi (AAS). AAS-I meetod põhineb vabade aatomite võimel absorbeerida kiirgusenergiat. Määratakse kiirgusallikast lähtuva valguse intensiivsuse vähenemine proovi sisaldava mõõteraku läbimisel, mõõterakuks on tavaliselt gaasipõleti leek või grafiitahjust saadav kuumade gaaside pilv. Joonisel 4 on toodud ühekiirelise leegi põhimõttel töötava AA-spektrofotomeetri põhimõtteline skeem.
Küttegaasideks on tavaliselt õhk ja atsetüleen ( propaan ). Kiirgusallikaks (2) on õõneskatoodlamp, mis kujutab endast silindrikujulist kvartsist eesaknaga klaasanumat.
AAS on vaba spektraalsetest segajatest, kuna õõneskatoodlambist lähtuvat valgust võivad absorbeerida ainult lambi katoodi materjaliks oleva elemendi aatomid . Meetod ei ole vaba keemilistest segajatest , mis esinevad leegiga AAS meetodil ning mis võivad mõjutada aatomite kontsentratsiooni leegis. /22/23/40/
4 12
11
13
3 5 6
- + 2 9
10
1
14
7 8
Joonis: 4 Aatomabsorptsioon- spektrofotomeeter

4.2 Leek- AAS

Atomisaatorina toimiv leek saadakse gaaside segu – põleva gaasi (kütuse), enamasti atsetüleen ja oksüdeerija (enamasti õhk) – põlemisel. Proovi sisaldav lahus pihustatakse spetsiaalses pihustis peenikeseks uduks (in. k. nebulization), mis seguneb põleva gaasi ja oksüdeerija seguga ning kantakse koos selle seguga põleti leeki. Leegis kõrge temperatuuri toimel vesi aurustub, järelejäänud tahked ained sulavad, aurustuvad ning atomiseeruvad .
Proovis mingi konkreetse elemendi määramiseks suunatakse leegile kiirgus, mille kvantide energia vastab täpselt vastava elemendi mõnele ergastusenergiale (kuna kõigil elementidel on palju erinevaid ergastunud olekuid, siis on ka palju erinevaid ergastusenergiaid). Teiste sõnadega: kiirguse kiirgusjoone lainepikkus langeb täpselt kokku uuritava elemendi mõne neeldumisjoone lainepikkusega. Sellist kiirgust saadakse niinimetatud õõneskatoodlambi abil. Leegis asuvad aatomid neelavad seda kiirgust ning ergastuvad. Seetõttu on kiirguse intensiivsus peale leegi läbimist madalam kui enne leeki sisenemist. Kiirguse intensiivsus väheneb seda rohkem, mida rohkem on leegis selle elemendi aatomeid. Kiirguse vähenemist kirjeldab matemaatiliselt Beeri seadus. Beeri seadus on ka kvantitatiivse määramise aluseks. Erinevalt molekulspektroskoopiast kehtib Beeri seadus AAS meetodi puhul enamasti vaid suhteliselt kitsas kontsentratsioonide vahemikus. AAS puhul saab mõnikord töötada ka mittelineaarses alas , ent see pole enamasti vajalik ja soovitatav, kuna kaotatakse enamasti tundlikkuses.
Ergastunud aatomid ei jää igavesti ergastunuks. Nad naasevad põhiolekusse ja kiirgavad taas kvante. Need kvandid kiirguvad aga suvalises suunas ning detektorisse jõuab neist vaid tühine osa. Seetõttu võime lugeda kõiki aatomite poolt neelatud kvante neeldunuiks./22/23/40/

4.3 Segajad

4.3.1 Grafiit-AAS määramisel

Füüsikalised segajad. Põhilised füüsikalistest segajatest põhjustatud probleemid on seotud pindpinevuse, viskoossuse ja fooni absorptsiooniga. Probleemiks võib olla proovi viskoossus . Liigselt viskoosse proovi puhul võib automaatne proovisisestaja jätta väikeseid koguseid kapillaari välisküljele. See kogus varieerub hiljem mitmete sisestuste jooksul ja annab halva korduvuse. /24/25/
Fooni absorptsioon on kõige enam esinev ja kõige rohkem kirjeldatud füüsikaline segaja. Süsiniku osakesed võivad vabaneda torust atomiseerimise faasis, nõrgendades koheselt valguskiirt. Peale tuhastamist alles jääv orgaaniline aine võib süttida, tekkiv suits aga viib valgusvoo nõrgenemisele. Samuti põhjustab enamik sooli märkimisväärset fooni absorptsiooni, kui neid leidub veel atomiseerumise ajal. /25/
Keemilised segajad. Toimuda võib stabiilse ühendi moodustumine, kui analüüsitav element reageerib süsiniku või lämmastikuga ja temperatuur ei ole veel piisavalt kõrge, et lahutada need elemendid atomiseerimise ajal. Seda on võimalik vältida, kasutades pürolüütiliselt kaetud grafiittorusid ja inertgaasina argooni. Lenduva ühendi moodustumist tuleks vältida, tõkestades elemendi enneaegse kadumise tuhastamise faasi jooksul. Enamik metallikloriide näitab sellist suundumust. Kasutada tuleb maatriksi modifikatsiooni, viies metalli teise ühendi koosseisu, mis püsib stabiilne ka kõrgematel temperatuuridel . Näiteks maksimaalne tuhastamise temperatuur BaCl2 jaoks on 900 ˚C, aga minimaalne tuhastustemperatuur BaO jaoks on 1500 ˚C. /25/
Hapete valik on selle meetodi rakendamise juures samuti väga oluline. Mõned happed tekitavad mitmesuguseid häireid. Mõni suurendab tulemust sõltuvalt elemendist, mida analüüsitakse. Üldiselt tuleks vältida vesinikkloriidhapet, kuna see soodustab lenduva ühendi moodustamist. /24/25/
Kontrollimaks segajate olemasolu, on vaja paika panna standardid ja konstrueerida kalibreerimiskõver. Standardi lisamist tuleks kasutada proovi puhul, mis näitab madalaid absorptsioone. Keemilise modifikaatori ja/või platformi kasutamisel tuleb uuesti optimeerida tuhastamise ja atomiseerimise temperatuurid. Kui kõik katsed vähendada segamist jäävad eduta, tuleks kasutada iga proovi jaoks standardi lisamise meetodit või valmistada proovisarnase maatriksiga standardid. /25/
Elektrotermilise AAS-i puhul tuleneb segamine põhiliselt söestamise protsessi muutlikkusest. Kui söestamise protsess oleks 100%-liselt efektiivne, siis kogu maatriks eemalduks (aurustuks) ja ei oleks mingit fooni absorptsiooni. Samas tuleb arvestada, et analüüsitavad aatomid peavad peale tuhastamise protsessi alles jääma. Proovi tüübist ja analüüsitavatest aatomitest tuleneb tuhastamise temperatuur ja efektiivsus. Efektiivsus oleneb maatriksi ja analüüsitava osa koostisosade lenduvusest. Oluline on seega, et maatriksi komponendid oleksid lenduvamad analüüsitava osa komponentidest. Sageli aitavad seda saavutada nn. maatriksmodifikaatorid. Modifikaatorid valitakse selle järgi, et nad kas suurendavad maatriksi lenduvust või vähendavad uuritava osa lenduvust. /26/
Grafiit-aatomabsorptsiooni puhul on segamine tunduvalt vähenenud seoses pürolüütiliselt kaetud küvettide kasutuselevõtuga. Sellised küvetid võimaldavad kasutada proovide mineraliseerimiseks hapete segusid. Analüüsides selliste grafiitküvettideta võis osa proovist lenduda ühel temperatuuril – vastavalt nitraatidele, kuna teine osa proovist lendus teisel temperatuuril – vastavalt kloriididele. Paljud kloriidid on küllaltki lenduvad ja võivad lenduda tuhastamise protsessis ning seega kaduma minna. /24/26/
Seoses grafiitküvetitüüpide arenguga, näiteks L’vov platvormküveti puhul, proov aurustatakse pigem kiirgusega, kui konvektsiooniga viies aeglasemale ja rohkem kontrollitavale aatomite vabanemisele. Aatomid aurustatakse mitte küveti seintelt, vaid platvormilt. Aeglase vabanemise tulemusena atomiseeritakse proov protsessi mõõtmisfaasis ja erinevate soolade (nitraadid, kloriidid) mõju väheneb. Lisaks on ka keemiline segamine (nt. aatomite taasühinemine) väiksem tänu temperatuurile, mis on platvormiga küveti puhul proovi aurustamise ajal kõrgem. /1/5/4.

4.4 Avastamispiir (ka detekteerimispiir),(LoD)

Avastamispiir on vähim analüüsisisaldus proovis, mida on antud meetodiga veel võimalik usaldusväärselt detekteerida ja identifitseerida. Allpool seda piiri on korrektne esitada tulemus näit. „analüüsi sisaldus proovis on alla avastamispiiri“ või “analüüdi esinemist proovis pole käesoleva meetodiga võimalik kindlaks teha“.
Avastamispiiri leidmiseks on erinevaid matemaatilisi lähenemisviise.
Väiksem mõõdetav suurus x1 võib esitada järgneva võrrandiga.
xl = xbl + k sbl
k-numbriline faktor, vastavalt eeldatud tasandil
x bl- tühiproovi keskmine
s bl- tühiproovi standardhälve
sageli võetakse avastamispiiriks sbl või 3x signaal - müra suhe
AA-spektromeetrias on levinud meetod avastamispiiri leidmiseks- R(ulatus) kaarti koostamine, kus mõõdetakse 10-l erineval korral uuritava elemendi tühiproovi signaali ( tehes kaks paralleelkatset).

4.5 Määramispiir (ka kvantitseerimispiir), (LoQ)

Madalaim analüüdi sisaldus proovis, mida antud meetod võimaldab usaldusväärselt kvantitiivselt määrata. Alates sellest piirist on õigustatud kvantitiivse analüüsi tulemuse esitamine numbriliselt. Tavaliselt võetakse määramispiiriks 10 sbl või 10x signaal- müra suhe.
Määramispiiri saab ka arvutada kasutades R-kaarti. Määramispiiri ja avastamispiiri vahele jäävas sisalduste vahemikus on soovitav tulemus esitada näit. „ analüüt esineb jälgedes“ ( trace element).

4.6 Lineaarne ala

Meetodi lineaarne ala on kalibreerimisgraafiku ala, mille analüütilise signaali sõltuvus analüüdi kontsentratsioonist on lineaarne. Meetodi tööala on kalibreerimisgraafiku ala, alates kõige madalama kontsentratsiooniga standardlahusest ning lõpetades kõige kõrgema kontsentratsiooniga standardlahusega. Eelistatult peaks meetodi tööala olema lineaarses alas, kuid see pole alati võimalik.

4.7 Tõesus

Meetodi tõesus on meetodi omadus anda tulemusi, mis on lähedased tõelisele väärtusele. Meetodi õigsuse iseloomustajaks on viga. Viga koosneb süstemaatilisest ja juhuslikust komponendist. Kuna igasuguse mõõtesuuruse (sealhulgas ka analüüsitulemuse) tõeline väärtus teadmata ja seda pole reeglina põhimõtteliselt võimalik teada saada, on meetodi tõesus teatud määral abstraktne mõiste. Samas omandab meetodi tõesuse mõiste küllaltki konkreetse sisu näiteks sellisel juhul, kui analüüsimeetodit kontrollitakse sertifitseeritud referentsmaterjali analüüsimise teel. Sellisel juhul õigustatud eeldada, et tõeline väärtus asub referentsmaterjali referentsväärtuse määramatuse piirides. /27/30/

4.8 Täpsus

Terminit täpsus kasutatakse kahes tähenduses:

• täpsus tõesuse mõiste
  
• täpsus kordustäpsuse mõistes: kordusmõõtmiste tulemuste omavahelist kokkulangevust iseloomustav suurus.
  

Kui kordusmõõtmised on tehtud lühikese ajavahemiku jooksul samas laboris sama inimese poolt samades tingimustes, räägitakse korduvusest. Kui pikema ajaperioodi jooksul või eri laborites või eri töötajate poolt või muul moel erinevatel tingimustel, räägitakse korratavusest. Korduvus ei vaja lisaselgitusi- kõik tingimused püütakse hoida võimalikult samad. Seevastu korratavuse juurde tuleb alati juurde märkida, milliseid tingimusi varieeriti ja milliseid hoiti samad.
Kordustäpsuse- nii korduvuse kui ka korratavuse- kvantitatiivseks väljendajaks on standardhälve SD
Kus xi on i-nda mõõtmise tulemus, x on mõõtmiste aritmeetiline keskmine, n on mõõtmiste arv. Standardhälbe ruutu nimetatakse dispersiooniks. Korduvust määratakse enamasti sellel eesmärgil, et teda kasutada tulevikus määramatuse arvutuse juures. Kuna korduvus võib erinevatel päevadel olla erinev, siis võib lihtsalt ühel konkreetsel päeval määrata korduvus osutuda ebaadekvaatseks ning oleks kasulik, kui korduvust saaks määrata selliselt, et oleksid kaasatud erinevate päevade andmed. Sellise võimaluse annab kogutud standardhälbe kasutamine. Kogutud standardhälve S-kogutud avaldub järgmiselt:
Kus k on erinevate mõõteseeriate arv, ni....nk on mõõtmiste arvud mõõtmisseeriates, si....sk on erinevate mõõteseeriate standardhälbed. Kogutud standardhälve annab üldiselt usaldusväärsema korduvuse hinnangu kui lihtsalt standardhälve. Seejuures võivad erinevad mõõteseeriad olla läbi viidud erinevate perioodidega ja neil võivad olla erinevad mõõteväärtused. Need mõõteväärtused peaksid aga olema sarnased, sest reeglina mõõtmise korduvus sõltub mõõteväärtusest. /27/30/

4.9 Mõõtemääramatus

Mõõtemääramatus e. Määramatus on mõõte- või analüüsitulemusele omistavate võimalike väärtuste hajusust iseloomustav parameeter . Määramatus on põhiline tulemuste usaldusväärsust iseloomustav parameeter.
Mõõdis xi on üksikmõõtmisel saadud väärtus, näiteks mõõteriista näit ühekorsel lugemi võtmisel või ühe tiitrimise tulemus.
Mõõteväärtuse parimaks hinnanguks normaaljaotusele alluvate xi puhul on nende mõõdiste aritmeetiline keskmine x.
Mõõtetulemus on mõõdetavale omistavate väärtuste kogum, mis võib olla esitatud:

mõõteväärtuse ja mõõtemääramatusega

vahemiku kujul, milles asub (leppeline) tõeline väärtus teatud tõenäosusega;

mõõtevahendi näiduga ja antud mõõtevahendilubatud vea piiridega.
Kui mõõtemääramatus on väljendatud standardhälbe tasemel, siis nimetatakse seda standardmääramatuseks ja tähistatakse u(x). See võrdub vastavastandardhälbe absoluutväärtusega, ehk u(x) on defineeritud nagu vektori moodul (ainult “+” märgiga, mitte “+-“!)
Enamasti ei ole mõõtetulemuseks lihtsalt mõõteriista näit. Keerulisemate mõõtmiste tulemus saadakse üldiselt mitme erineva lihtsama mõõtmise tulemuste arvutamiste teel. Sellisel juhul käsitletakse lihtsamate mõõtmiste tulemusi sisendsuurustena ning keerulisema mõõtmise tulemus väljundsuurusena. Kui mingi mõõtmise puhul väljundsuurus Y sõltub mitmest sisendsuurustest X1, X2... Xn siis selle sõltuvuse võime kirjutada : Y= F ( X1,X2...Xn). võrrandit nimetatakse vastava mõõtmise matemaatiliseks mudeliks.
Väljundsuuruse määramatuse hindamisel võetakse arvesse kõigi sisendsuuruste standardmääramatused. Niiviisi hinnatud väljundsuuruse standardmääramatust nimetatakse liitstandardmääramatuseks ja tähistatakse uc(x).
Eksperimentaalse standardhälbe kaudu väljendatud standardmääramatuse hinnangut nimetatakse standardmääramatuse A-tüüpi hinnanguks.
Mõningaid väljundsuuruse määramatuse komponente, näiteks põhiaine puhtuse standardmääramatust, ei ole võimalik katsetulemuste statistilise töötlemise abil hinnata. Kõiki selliseid määramatuse hinnanguid, milles ei kasutata statistilisi meetodeid , nimetatakse määramatuse B-tüüpi hinnanguteks. Näiteks põhiaine puhtuse määramatust hinnatakse tootja poolt antud sertifikaadis sisalduva info alusel, mõõtevahendite lubatud veapiiride kohta leiab teavet mõõtevahendite kasutamisjuhenditest, passidest või muudest dokumentidest. Neil juhtudel toimub määramatuse hindamine mittestatistiliste meetodiga (B-tüüpi hinnang)
Tulenevalt normaaljaotuse omadustest väljendab mõõtetulemuse standardmääramatus selliseid piire , mille sees paikneb mõõdetava suuruse tõeline väärtus ca 68% tõenäosusega. Sellest kõrgema usaldatavusega mõõtetulemuse saamiseks tuleb mõõtemääramatust Uc (y) korrutada vastava katteteguriga k.
Kui K=2, siis saadakse mõõtetulemus usaldatavusega ca 95,4%. Sel juhul mõõdetava tõeline väärtus xt asub ca 95% tõenäosusega vahemikus x-k * uc(x)  xt x +k*uc(x)
Kompaktsemalt kirjutatakse seesama mõõtetulemus järgmiselt: xt= [x± k*uc(x)][X], kus [X] on mõõdetava suuruse ühik. Parameetrit k*uc(x) tähistatakse U ja nimetatakse laiendmääramatuseks, mille defineeriv valem on U= k*uc(x). /30/

4.10 Saagis

Meetodi saagis iseloomustab meetodi võimet määrata kogu proovis sisaldav analüüt. Saagist väljendatakse enamasti protsentides. Saagise väärtused alla 100% on tingitud sellest, et osa analüüti jääb mingil põhjusel määramata. Saagise määramiseks on kolm põhilist võtet:

kasutada rikastatud proove- st. proove, kuhu on kindel kogus analüüti lisatud.

kasutada referentsmaterjale. Referentsmaterjal on materjal, mille üks või mitu omadust piisavalt usaldusväärselt teada, et seda kasutada kalibreerimiseks, meetodi antavate tulemuste kontrolliks, meetodite valideerimiseks või teistele referentsmaterjalide väärtuste omistamiseks.

kasutada võrdluseks tulemust, mis on saadud teistsugusel põhimõttel töötava meetodi abil.
Meetodi saagis võib olla märkimisväärselt erinev madalate ja kõrgete analüüdi sisalduste juures. Seetõttu on juhul, kui meetodit kasutatakse erinevate analüüdi sisalduste juures, vaja määrata saagis eraldi madala ja kõrge kontsentratsiooni juures

5. Eksperimentaalne osa

Cu ja Zn sisalduse määramine Leek-AAS meetodil

Proovidest(v.a vesi) saab määrata metallide sisaldust proovi happes lahustuvast osast tema mineraliseerimise teel hapetega,

Reaktiivid

Proovide eeltöötlemisel ja kalibreerimisel kasutatakse analüüsipuhtaid reaktiive .

Lämmastikhape 65% “suprapur” Merck;

Vesinikperoksiid 36-38% “for trace metal analsis”, Baker;

Cu ja Zn standardlahus 1000mg/l- (Cu,Zn Atomic Spectroscopy Standard Solution );

sertifitseeritud referents materjalid- Quality Control Standard QCS-26-High Purity Standards;

Lahuste valmistamisel kasutasin ioonvaba vett;

Kasutatavad gaasid – atsetüleen ja argoon firma AGA;

pesulahusena kasutasin 2,5% Decon 90 lahust;

pesuhappeks kasutasin 1 mol/L lämmastikhapet;

Seadmed ja vahendid

Klaas ja plastnõusid, mis on metallivabad ( mitte pruunist klaasist);

AA-spektrofotomeeter SpectraAA 220F ( Varian, Austraalia );

Mikrolaine mineralisaator AntonPaar Multiwave 3000;

MilliQ Water System, Millipore filtrid ;

Kuivatuskapp OHGO 97; Sanyo Gallenkamp

Lahuste valmistamiseks kasutasin A-klassi kolbe ja pipette;

5.2 AAS külmauru meetod Hg määramiseks

metoodika on ette nähtud metallide sisalduse määramiseks proovide sellest osast, mis lahustub happes. Proovi eeltöötlemise moodusena kasutatakse happeseguga mineraliseerimist mikrolainemineralisaatoris.

Reaktiivid

Proovide eeltöötlemisel ja kalibreerimisel kasutatakse analüüsipuhtaid reaktiive:

Lämmastikhape 65% “suprapur” Merck;

Soolhape HCL 37% “for trace metal analysis ” (Riedel de Haen);

Sn-kloriid SnCl2 -“for trace metal analysis” (Riedel de Haen);

destilleeritud vesi, milliQ vesi
Hg lähtestandardlahus on 1000 mg/l (automatic Spectroscopy Standard Solution, Fluca). Lahuste valmistamisel kasutasin milliQ vett. Pesulahusena kasutasin 2,5% Decon 90 lahust.
Standardlahused : 2,5; 5,0; 10 ja 20 ng/ml 6MHCL, mis vaisttakse samades tingimustes kui proovid

Seadmed ja vahendid

Instrument- AAS SpectraAA 220FS

Hg aurukogumisekvartsküvett

VGA- 77 pump

Gaas - argoon

5.3 Pb ja Cd sisalduse määramine elektrotermilise

aatomabsorptsioon spektrofotomeetrilisel (ETAAS) meetodil

Metoodika on ette nähtud metallide sisalduse määramiseks proovide sellest osast, mis lahustub happes. Proovi eeltöötlemise moodusena kasutatakse happeseguga mineraliseerimist mikrolainemineralisaatoris.
Elementide sisalduse määramisel tuleb olla ettevaatlik kuna määratavad sisaldused on ng/ml, on saastumise oht reaktiividest.

Lämmastikhape 65% “suprapur” Merck;

Vesinikperoksiid 36-38% “for trace metal analsis”, Baker;

Metallide lähtestandardlahus 1000mg/l- (Atomic Spectroscopy Standard Solution, Fluca);

Destilleeritud vesi, milliQ vesi

Seadmed ja vahendid

Klaas ja plastnõusid, mis on metallivabad ( mitte pruunist klaasist);

AA-spektrofotomeeter SpectraAA 220Z ( Varian, Austraalia);

Mikrolaine mineralisaator AntonPaar Multiwave 3000;

MilliQ Water System, Millipore filtrid;

Kuivatuskapp OHGO 97; Sanyo Gallenkamp

Lahuste valmistamiseks kasutasin A-klassi kolbe ja pipette;
Kasutasin sertifitseeritud referentsmaterjali “Shirmp Powder for APLAC T057”. 2007a jaanuaris osales Keemilise analüüsi teadus ja katselabor interkalibreerimisel “Proficiency testing programme on heavy metals in food”, kus antud referentsmaterjal andis väga head tulemused .
Tabel:2 Keemilise analüüsi teadus ja katselabori tulemus interkalibreerimisel
Mean . Conc. Mg/kg
Z- score
Cd
0,209
0,54
Pb
1,31
0,28
Z-score tulemust ±1 loetakse väga heaks tulemuseks.
Mõõtemääramatus – Pb (Lisa3)
X-kaart (Pb) (Lisa 4)

5.4 Proovide eeltöötlus

Bioloogiliste proovide mineraliseerimine toimub deflonnõudes mikrolaine mineralisaatoris. Analüüsiks võtsime 1-2g kala lihast v. maksa, mille viisime deflonnõudesse ja lisasime 6ml HNO3 ja 1 ml H2O2 .
Mineraliseerimine mikrolaine mineralisaatoris Anton-Paar vastavalt programmile. Mikrolaine mineralisaatori programm- rõhk : 19 bar; kiirus 0,2 ba/sek; temp 180ºC; võimsus 850W.
Tabe:3. Mikrolainemineralisatori mineraliseerimise programm
Aste
Võimsus(W)
Temp.tõusu, kiirus (sek)
Hoidmine, aeg (sek)
1
850
15
15
2
0
0
15
Jahutasin proovi ning viisin üle 25ml mõõtekolbidesse ja lahjendasin milliQ veega 15ml´ni
Hg määramiseks lisasin 2 ml 30% HCL ja ja lahjendasin 25ml dest veega.
Kalibreerimiseks kasutatakse vähemalt kolme standardlahust ja 0-proovi ( 100ml kolbi viiakse 0,5ml lämmastikhapet ja täidetakse kolb märgini). Kasutasin 0,1; 0,2 ja 0,5 mg/l mis on valmistatud lähtestandardlahusest 1000 mg/l.

Kuivaine sisalduse määramine

Bioloogilist materjali kaaluda kaalutopsidesse 1-1,5 g
Kuivatada kuivatusahjus 105ºC juures 7h konstantse kaaluni.
Arvutatakse:

5.5 Elementide mõõteparameetrid

5.5.1 Vask (Cu)

Põhilahus 1 mg/ml firma “Fluka”
Instrumentaal tingimused
Lainepikkus 324,8 nm
Lambivool 4 mA
Leek
Pilu 0,5nm
Leegi tüüp õhk-atsetüleen
Tundlikkus 0,041 mg/l
Signaal 3,7 mg/l annab 0,4 A
Optimaalne tööpiirkond 0,02-10 mg/L
Avastamispiir (LoD) 0,005 mg/L
Määramispiir (LoQ) 0,011 mg/L
Lineaarne mõõtepiirkond 0,03-10 mg/L

5.5.2 Tsink (Zn)

põhilahus 1 mg/ml firma “Fluka”
Instrumentaal tingimused
Lainepikkus 213.9 nm
Lambivool 5 mA
Leek
Pilu 0,1 nm
Leegi tüüp õhk- atsetüleen
Tundlikus 0.013 mg/l
Signaal 1.2 mg/l annab 0,4 A
Optimaalne piirkond 0,02-2,0 mg/l
Avastamispiir (LoD) 0,003 mg/L
Määramispiir (LoQ) 0,007 mg/L
Lineaarne mõõtepiirkond 0,01-2 mg/L

5.5.3 Plii (Pb)

Aparaadi reziim ABSORPTSIOON
Kalibreerimise reziim KONTSENTRATSIOON ng/ml
Mõõtmise reziim PIIGI PINDALA
Lambi vool (mA) 5
Pilu laius (nm) 0,5
Grafiitahju süstiva proovi maht, l 10
Lainepikkus (nm) 283,3
Proovi käsitlus AUTOSAMPLER
Küveti tüüp pürolüütiliselt kaetud platformiga
Inertgaas ARGOON 99,98% AGA
Avastamispiir (LoD) (1,20 ng/ml)... mg/L
Määramispiir (LoQ) 2,81ng/ml).... mg/L
Optiline määramispiir ( 3-50 ng/ml)....

5.5.4 Kaadmium (cd)

Aparaadi reziim ABSORPTSIOON
Kalibreerimise reziim KONTSENTRATSIOON ng/ml
Mõõtmise reziim PIIGI PINDALA
Lambi vool (mA) 10
Pilu laius (nm) 0,5
Grafiitahju süstiva proovi maht, l 10
Lainepikkus (nm) 228,8
Proovi käsitlus AUTOSAMPLER
Küveti tüüp pürolüütiliselt kaetud platformiga
Avastamispiir (LoD) (0,024 ng/ml) mg/L
Määramispiir (LoQ) (0,057 ng/ml) mg/L
Optiline määramispiir ( 0,06-5,0 ng/ml)....

5.5.5 Elavhõbe (Hg)

Hg aurukogumiseks kvartsküvett
Gaas argoon
Lainepikkus 357,8 nm
Lambi vool 4 mA
Background D2 lamp
Avastamispiir (LoD) 0,10 ng/mL
Määramispiir (LoQ) 0,30 ng/mL

6. Andmete statistiline analüüs.

Analüüsi tulemuste põhjal on arvutatud järgnevad statistilised näitajad:

• Aritmeetiline keskmine
  

• Standardhälve- Juhusliku suuruse hajuvust iseloomustav karakteristik.
  

• Standardviga - SE nimetatakse aritmeetilise keskmise kui keskväärtuse hinnangu standardhälvet, arvutatakse valmeiga
  

Andmete statistilisel töötlemisel kasutati tabelarvutusprogrammi
“ Microsoft Excel 2000” /28/30/
Korrelatsioonid on arvutatud statistika programm Statistica 8.0

7. Tulemused

Kõigi 80 2006/2007a Pärnu lahest püütud ahvenaproovi raskemetallisisaldus määrati AAS meetodil. Selle abil tehti kindlaks viie toksilise metalli: elavhõbe (Hg), plii (Pb), kaadmium (Cd), tsink (Zn) ja vask (Cu), sisaldused kahes erinevas koes: maksas kui elusorganismide keskkonnast toidu- ja joogiga sisenevate mürkide kahjutustamise kohas ja lihastes kui inimtoiduks tarvitatavas osas. Saadud tulemusi töödeldi erinevate statistiliste meetoditega, et kontrollida nende usaldusväärsust ja erinevuste olulisust.
Analüüsitulemusi võrreldi omavahel neljas kategoorias:

sisalduse sõltuvus ahvena pikkusest (L, cm): 9-15; 16-20; 21-25; 26-30; 31-35 (Joonis:9; 10; Tabel:8;9 )

sisalduse sõltuvus ahvena vanusest: ühe- kuni kaheksa-aastased, (Tabel: 6; Joonis: 6;7 )

sisalduse sõltuvus ahvena soost: isased ja emased, ( Joonis:8; Tabel:7)

sisalduse sõltuvus uuritavast koest: lihaskude ja maksakude. (Lisa 2 ; Joonis: 11)

määrati Hg sisaldus ja võrreldi vanusega (Tabel 5; Joonis 5)
Eesti Vabariigi seadusandlus seab ette kindlad lubatavad piirarvud raskemetallisisaldusele kalas, s.h. ka ahvenas: plii (Pb) 1,0 mg/kg; kaadmium (Cd) 0,2 mg/kg; vask (Cu) 10 mg/kg; tsink (Zn) 40 mg/kg /6/.
Tabel 4: Keskmine sisaldus ahvena lihases ja lubatud normid.
Raskemetall
Sisaldus Pärnu lahe ahvena lihases aver./ mg/kg
Lubatud piirnorm Kalalihas mg/kg
Plii (Pb)
0,11
1,0
Kaadmium (Cd)
0,03
0,2
Tsink(Zn)
24,67
40
Vask (Cu)
1,53
10
Üheks töö tulemuseks seega anda hinnang nii keskkonnaseisundile kui ka ahvenaliha kõlblikkusele inimtoiduks.
Saadud tulemuste analüüsimiseks on kasutatud andmete statistilist töötlemist. ( Excel; Statistica 8,0)

7.1 Elavhõbe (Hg)

Tabel 5: Elavhõbeda sisaldus sõltuvalt vanusest.
N
vanus
Hg mg/kg (aver.)
±SD
±SE
8
2
0.18
0.14
0.049
13
3
0.22
0.13
0.036
6
4
0.24
0.09
0.037
3
5
0.31
0.12
0.069
4
6
0.41
0.19
0.095
3
7
0.42
0.24
0.139
1
8
0.43
 
 
Joonis 5: Elavhõbeda sisaldus sõltuvalt ahvena vanusest.

7.2 Metallide sisaldus ahvenas sõltuvalt vanusest

Tabel 6: Metallide sisaldus sõltuvalt vanusest
n=
vanus
Cu
±SD
±SE
Pb
±SD
±SE
Cd
±SD
±SE
Zn
±SD
±SE
2
1L
2,114
0,230
0,163
0,071
0,004
0,003
0,005
0,047
0,033
25,654
3,760
2,659
2
1M
19,531
9,840
6,958
0,055
0,004
0,003
 
 
0,000
103,203
9,590
6,781
10
2L
1,810
0,680
0,215
0,130
0,150
0,047
0,030
0,060
0,019
25,811
6,760
2,138
5
2M
29,880
11,950
5,344
0,071
0,040
0,018
0,135
0,040
0,018
96,562
16,880
7,549
14
3L
1,528
0,860
0,230
0,085
0,080
0,021
0,024
0,030
0,008
22,391
7,400
1,978
5
3M
15,116
8,690
3,886
0,075
0,065
0,029
0,339
0,190
0,085
117,647
17,890
8,001
6
4L
1,370
0,740
0,302
0,068
0,041
0,017
0,013
0,017
0,007
21,159
3,220
1,315
5
4M
17,674
6,310
2,822
0,058
0,030
0,013
0,206
0,140
0,063
82,732
14,620
6,538
6
5L
1,361
0,780
0,318
0,122
0,055
0,022
0,009
0,011
0,004
24,905
2,570
1,049
4
5M
23,925
10,860
5,430
0,034
0,033
0,017
0,165
0,076
0,038
98,027
19,840
9,920
4
6L
2,245
1,550
0,775
0,244
0,180
0,090
0,014
0,024
0,012
24,444
9,200
4,600
3
6M
14,660
5,280
3,048
0,101
0,054
0,031
0,479
0,450
0,260
102,295
35,770
20,652
3
7L
1,463
0,840
0,485
0,084
0,042
0,024
0,003
0,003
0,002
22,366
7,180
4,145
3
7M
4,399
2,280
1,316
0,137
0,033
0,019
0,024
0,025
0,014
41,635
44,470
25,675
2
8L
0,919
0,002
0,001
0,044
0,039
0,028
0,003
0,003
0,002
26,885
13,150
9,298
2
8M
19,184
10,420
7,368
0,036
0,024
0,017
0,053
 
0,000
69,184
49,040
34,677
Joonis 6: metallide sisaldus ahvena lihases sõltuvalt vanusest
Joonis 7: metallide sisaldus ahvena maksas sõltuvalt vanusest

7.3 Metallides sisaldus ahvenas sõltuvalt soost

Tabel 7: Metallide sisaldus sõltuvalt ahvena soost [♀ (emane) ♂ (isane)]
 
N
Cu
± SD
±SE
Pb
± SD
±SE
Cd
± SD
±SE
Zn
± SD
±SE
♂lihas
13
2,112
0,583
0,162
0,137
0,146
0,040
0,049
0,034
0,009
25,478
5,907
1,638
♂ maks
8
24,810
11,843
4,187
0,073
0,056
0,020
0,355
0,233
0,082
102,452
20,780
7,347
♀ lihas
35
1,411
0,846
0,143
0,096
0,087
0,015
0,014
0,020
0,003
23,857
5,689
0,962
♀ maks
21
21,320
10,112
2,207
0,071
0,046
0,010
0,195
0,220
0,048
83,832
33,546
7,320
(a)
(b)
(c)
(d)
Joonis 8: metallide sisaldus sõltuvus soost. (a) Plii; (b) Kaadmium; (c) Tsink; (d) Vask

7.4 Metallide sisaldus ahvenas sõltuvalt pikkusest

Tabel 8:Metallide sisaldus ahvenas sõltuvalt pikkusest; Lihas
N
pikkus;cm
Cu
±SE
Pb
±SE
Cd
±SE
Zn
±SE
14
9-15
1,805
0,225
0,123
0,038
0,017
0,007
26,479
1,554
11
16-20
1,679
0,180
0,071
0,011
0,018
0,007
23,356
1,332
10
21-25
2,836
1,582
0,094
0,018
0,021
0,010
22,531
1,112
6
26-30
1,999
0,558
0,196
0,065
0,011
0,008
24,638
3,240
3
31-35
1,071
0,152
0,046
0,016
0,002
0,001
23,605
6,290
Joonis 9: Metallide sisaldus sõltuvalt pikkusest; Lihases
Tabel 9: Metallide sisaldus ahvenas sõltuvalt pikkusest; Maks
N
pikkus;cm
Cu
±SE
Pb
±SE
Cd
±SE
Zn
±SE
6
9-15
27,378
5,449
0,064
0,014
0,135
0,015
101,229
7,348
9
16-20
23,775
4,830
0,067
0,018
0,325
0,070
88,448
11,488
7
21-25
22,191
3,402
0,169
0,117
0,274
0,050
101,990
7,882
5
26-30
9,157
1,827
0,097
0,023
0,227
0,180
72,181
13,889
3
31-35
13,841
6,829
0,082
0,047
0,036
0,014
48,514
28,775
Joonis 10: Metallide sisaldus ahvenas sõltuvalt pikkusest; Maks

8. Arutelu

8.1 Vask (Cu)

Kalade lihastes on vähem metalle kui muudes kudedes
Vase sisaldus emaste ahvenate maksas varieerub piirides 2,24 kuni 26,49 mg/kg kuivmassi kohta ja isastes kalades 12,57 kuni 47,82mg/kg
Keskmiste andmete alusel on vase sisaldus isaste kalade maksas kõrgem kui emastes (joonis...), kuigi see erinevus ei ole statistiliselt usaldusväärne ( ANOVA , P>0,05).
Pikkuse järgi vase sisaldus maksas väheneb kala pikkuse kasvuga (tabel:...)
Võrreldes maksaga on vase sisaldused emaste ahvenate lihastes oluliselt madalamad kui isastes kalades (ANOVA; P0,05), statistiline erinevus väike. Emaste kalade lihases korreleerub Cd/Zn 0,376; P= 0,028 (P