Veekogude toksikoloogia (2)

Veekogude ökotoksikoloogia ja kalade füsioloogia
Arvo Tuvikene, Ph.D. EMÜ PKI Limnoloogiakeskus [email protected] Lektorid · Irina Zemit, EMÜ doktorant · Randel Kreitsberg, TÜ doktorant · Rene Freiberg, EMÜ doktorant Käsitletavad teemad · Toksiliste ainete grupid ­ Orgaanilised toksilised ained · Püsivad · Suhteliselt kiiresti lagunevad Rask (e)metallid · Ioonsed: Cu 2+ · Orgaanilised raskmetallid (metüülelavhõbe CH3-Hg, etüülplii C2H5-Pb) · Tributüültina (TBT) · Raskmetallide organismi sattumise erinevad teed Raskemetallide akumulatsioonifaktorid särje organismi ja sette vahel Mustajõgi Baltic TPP Riigiküla -5 -6 -5 Cd 5.8 · 10 1.1 · 10 4.9 · 10 -4 -4 Cu 0.4 6.7 · 10 3.1 · 10
Hg 15.8 13.5 5.9
Pb 0.003 0.007 0.01 Tuvikene et al. Fish Physiology, Toxicology, and Water Quality (2000) Ammooniumi toksilisus · Toksilisus sõltub vee pH-st · NH3 palju toksilisem kui NH4+ · LC50 96h vikerforellilie 0,16-1,1 mg/l NH3 (11-48 mg/l ammooniumlämmastikku) · Akuutne toksilisus langeb temperatuuri tõustes. · Kroonilise toksilisuse nähud hakkavad ilmnema vikerforellil alates 0,04mg/l Toksiliste ainete bioloogiline kättesaadavus Bioakumulatsiooni suurus oleneb ainete bioloogilisest kättesaadavusest. Bioloogiline mitmekordistumine · PCB-d · Dioksiinid · Pestitsiidid (DDT jt.) Ökoöstrogeenid ja -androgeenid · Ained, mis sarnanevad oma keemiliselt ehituselt suguhormoonidega. · Võivad seonduda hormooni jaoks mõeldud retseptoriga ja sellega blokeerib retseptori nii, et hormoon ei saa enam ühineda (TBT, nonüülfenoolid, jne.) Biomarkerid · Keemiliste detektorite abil ei suudeta me kõiki toksilisi aineid määrata · Ainult keemilised määramised ei anna meile infot toksiliste ainete mõju kohta organismidele · Tuleks kasutada senisest rohkem mitmesuguseid bioteste (biomarkerid, bioindeksid) paralleelselt keemiliste analüüsidega Mürgisuse paradoks · Paracelsius ( Sveitsi arst) ­ kõik ained võivad olla mürgised ­ mürgisuse määrab ära doos . Vee toksikoloogia alates 1970
Klassikaline toksikoloogia Keskkonnakeemia Lühike veetoksikoloogia ajalugu · Süsteemsed toksilisuse mõju laboratoorsed uurimised alates 1920 · Periood enne II maailmasõda. Kasutati zooplanktonit ja kalu nii laboris kui ka looduses. · Pärast II MS hakati meetodeid standardiseerima. Biokatsed "kurgipurkides" (5-25l) · Võeti kasutusele organismid erinevatelt troofilistelt tasanditelt · 1960-ndad:läbivoolusüsteemide kasutuselevõtmine (madala kontsentratsiooniga ainete krooniline mõju) · Vee füüsikaliste ja keemiliste faktorite arvestamine aine toksilisuse hindamisel · 1970 mikro - ja mesokosmosed · 1980 QSAR, sobivate biomarkerite otsimine ja kasutuselevõtt · Kaasajal on leitud, et keemiliste ainete sisaldusi (põhjus) tuleb vaadata koos bioloogiliste muutustega (tagajärg). · Arvutitoksikoloogia (Ränimeetod) Hääletu kevad
Rachel Carson, 1962 Esimene bioloogilise mitmekordistumise käsitlus ja teavitamine üldsusele Toksiliste ainete keemiline määramine Spektrofotomeetria, fluorimeetria, vedelikkromatograaf HPLC , gaaskromatograaf GC, mass- spektromeeter MS A
16 prioriteetse PAH-I kromatogramm Fen BaA + Chr Anaphtene +F
B(b)F B(k)F Flo B(a)P B(ghi)P N Anaphtylene P D(ah)A I(123)P
S Vesi
Vesi/ heljum 1:5000
Heljum PAHid ahvena lihastes ja PAHide akumulatsiooni suhe ahvena organismi ja sette vahel 4500 120 4000
3500 100
3000 80 3-ring ng/g DW
3-ring
B SAF 2500 4-ring 60 4-ring 2000 5-ring 5-ring 1500 40
1000 20 500 0 0 Mustajõgi Baltic TPP Riigiküla Mustajõgi Baltic TPP Riigiküla
Tuvikene et al. Fish Physiology, Toxicology, and Water Quality (2000) KOW Miks kasutatakse biomarkerid? · Annavad informatsiooni toksilise aine mõjust · Paljud kemikaalid (nt pestitsiidid, PASid) on organismis lühikese poolestusajaga, kuid nende mõju on pikaajaline · Biomarkerite abil saab määrata, kas täpsemad analüüsid on õigustatud Biomarker - mõõdetav bioloogiline reaktsioon teatud keemilisele ainele, mis võib avalduda ka kahjustusena
Walker et al., 1997 Muutused erinevatel bioloogilistel tasanditel ehk BIOMARKERID · Molekul : ensüümi sisaldus/aktiivsus, i-RNH, DNA sillad · Rakk: organellide funktsionaalsed ja struktuursed kõrvalekalded, mikrotuumad · Organ: histopatoloogilised kõrvalekalded, LSI, GSI Organismist kõrgemal tasemel nimetatakse indeksiteks · Organism: füsioloogilised parameetrid , kasvukiirus, viljakus · Populatsioon : vanuseline struktuur, suurusjaotus · Ökosüsteem: mitmekesisuse indeksid, funktsionaalsed parameetrid Etoksüresorufiin O-deetülaasi aktiivsused Emajões sumpades hoitud vikerforellide maksas 70 EROD pmol/min/mg prot.
60 50 40 winter 30 spring
20 10 0 R-1,5 E1 E3 E10
TARTU Tuvikene et al. Comp . Biohem. Physiol. 114 (1996) EROD aktiivsus
1000 p m o l/m in/m g p ro t
100 koha 10 latikas
1 lõuna kesk põhi Study sites GST aktiivsus
1600 1400 nmol/min/mg prot
1200 1000 koha 800 latikas 600 400 200 0 lõuna kesk põhi Study sites Mikrotuumade sagedus erütrotsüütides ( Palm & Krause , 1995)
Võrtsjärv Peipsi Matsalu laht Latikas 0,45
Haug 0,45 1,2
Ahven 0,3 1,5 2,1
Koha 0,3 1,4 Antioksüdant ensüümide aktiivsus vastuseks sinivetikate toksiinidele krabi (Chasmagnathus granulatus) hepatopankreases
Katalaas Glutaatiooni S- transferaas Superoksiid dismutaas Väliuuringud · Bioloogilise mitmekesisuse indeksid · Sumptestimine ( kalad , molluskid , veetaimed) · Mikro- ja mesokosmosed Laboratoorsed biotestid · Akuutsed (letaalsed) testid: 24 - 96h LC50 · Kroonilised testid: muutused ­ arengus ­ kasvus ­ paljunemises ­ ainevahetuses ­ füsioloogias ­ käitumises Läbivoolusüsteemid In vivo vs. in vitro testid · Eelised ja puudused · Hind · Humaansus · Andmete tõlgendamine organisatsiooniliselt kõrgemale tasandile ja sellega kaasnevad probleemid RAKUKULTUURID · Primaarkultuur , kalade lõpuse epiteelirakkude kultuur · Monoklonaalsed rakukultuurid, PLHC -1 · Vetikakultuurid · Bakterkultuurid, Vibrio fischeri Lõpuse epiteelirakkude kultuur
K+
Ca2+ Cl- Na+ Cd2+ Rakukultuurid · Probleemid selles, kas in vitro testid kirjeldavad protsesse, mis toimuvad in vivo. · Probleem selles, et rakukultuurid on elusorganismi lihtsustatud mudelid ja kõike funktsioone, mis elusorganismil esineb, rakul ei esine. · Areng selles suunas, et asendada loomkatseid. · Praktika näitab, et in vitro katsed ei asenda kaugeltki veel loomkatseid ­ ravimite ja teiste keemiliste ainete ohutust ei osata veel piisavalt hinnata in vitro katsete abil Mida määratakse rakukultuuride puhul · Rakkude suremust · Üldvalgu hulka · Mingi ensüümi aktiivsust · Bioluminestsentsi PLHC-1 rakukultuur
EROD activity
16 14 South pmol/min/mg prot
12 Middle 10 North 8 6 4 2 0 5 10 20 30 40 50 60 70 Extract from dry sediment (mg per ml medium ) Vibrio fischeri bakterirakkude bioluminestsents Water of River Emajõgi and Narva 120 100 80 60 40 5 15 20 30 0 - 20Kvissental Praaga PPS Vasknarva Tank Merekyla
- 40 - 60
NARVA TARTU Kalade haismise uurimiseks kasutatakse elektrofüsioloogilisi ja käitumiskatseid Kala olfaktoorne organ 1% põlevkivituha ekstrakt Balti SEJ tuamägedelt Balti SEJ tuhavesi. Ohutu kontsentratsioon