Geneetika ajalugu. (1)

GENEETIKA AJALUGU
19. sajandil tegutses Brno kloostris munk Gregor Mendel, kes viis läbi katseid aedhernega. 1865. aastal sõnastas ta pärilikkuse üldprintsiibid. Sellega sai alguse ka teadusliku geneetika periood. Mendeli I seadus ehk esimese hübriidse põlvkonna ühtlikkuse seadus: homosügootsete vanemate ristamisel saadakse esimeses järglaspõlvkonnas genotüübiliselt identsed ja fenotüübiliselt ühtlikud järglased. Mendeli II seadus ehk alleelide lahknemise seadus: monohübriidse ristamise teises hübriidpõlvkonnas saadakse genotüübiline lahknemissuhe 1:2:1 ja fenotüübiline lahknemissuhe 3:1 või 1:2:1. Mendeli III seadus ehk sõltumatu lahknemise seadus: erinevad alleelipaarid segregeeruvad ja kombineruvad üksteisest sõltumatult. Polühübriid moodustab võrdse sagedusega 2n haplotüübiga gameeti, kus n on heterosügootsete geenipaarde arv. Ganeetide ühinemisel võib tekkida 3n erineva genotüübiga sügooti kindlate sagedustega.
1900. aastal Mendeli seaduste taasavastamine kolme sõltumatu teadlase poolt- Hugo de Vries, Carl Correns ja Eric von Tscermak-Seysenegg. 1910 -1925- pärilikkuse kromosoomiteooria, T.H. Morgan . 1941. aastal avastati, et geen kodeerib valku 1944. aastal tõestas O. Avery, et pärilikkust kandev materjal on desoksüribonukleiinhape. 1953. aastal kirjeldasid J. D. Watson ja F. H. C. Crick DNA kaksikheeliksi struktuuri. 1961. aastal avastati, et geneetiline kood on kirjutatud kolmest nukleotiidist koosnevate triplettidena 1961. aastal avastati mRNA ning F. Jacob ning J. Monod avaldasid geeni regulatsiooni operonimudeli 1970. aastal avastasid H. Temin ja D. Baltimore retroviirustest ensüümi pöördtranskriptaas, mille abil toimub DNA süntees RNA-lt. 1977. aastal töötati välja meetodid, millega oli võimalik DNA-d suurtes hulkades lugeda. PÄRANDUMISE ALUSED DNA (desoksüribonukleiinhape)
Ehitus. DNA on madalmolekulaarne aine, mis koosneb viiesüsinikulisest suhkrust desoksüriboos, fosfaatrühmast ja lämmastikalusest. Fosfaatgrupp ja lämmastikgrupp moodustavad lämmastikaluse. Lämmastikaluseid nimetatakse vastavalt lämmastikgrupile järgnevalt- adenosiinfosfaat , tsütidiinfosfaat, guanosiinfosfaat ja tümidiinfosfaat. DNA primaarseks struktuuriks on aluspaariline järjestus. Sekundaarseks struktuuriks on aga biheeliks ehk kaksikahel. DNA primaarne struktuur moodustub lämmastikaluste üksteisele vastavuse ehk komplementaarsuse alusel. Lämmastikalusteks DNA puhul on adeniin , tsütosiin, tümiin ja guaniin . Üksteisele vatavus on järgnev- adeniin moodustab kahe vesiniksideme abil sideme tümiiniga ja guaniin kolme vesiniksideme abil tsütosiiniga. DNA on pakitud histoonide abil. Tähtis on teada ka, et DNA ahelad on antiparalleelsed, ehk siis kokkuleppeliselt on üks ahel 5´-3´ ja teine ahel 3´-5´. DNA kahekordistumisprotsessi nimetatakse replikatsiooniks. Protsessi viib läbi ensüüm DNA polümeraas. DNA kahekordistumine toimub semikonservatiivse mudeli järgi. See tähendab, et mõlemale vanale ahelale sünteesitakse kõrvale uus. Replikatsioon toimub 5´-3´ suunas. Protsessis on üks ahelatest juhtiv ( leading strand ) ja teine mahajääv ahel (lagging strand). Juhtivalt ahelalt toimub süntees pidevalt, kuid mahajääval ahelal toimub süntees 100-1000 nukleotiidiste blokkidena ehk Okazaki fragmentidena. Nende fragmentide sünteesiks kasutatakse RNA praimereid. Hiljem liidetakse tekkinud fragmendid esüümi ligaas abil. Kuna DNA repikatsiooni puhul tekib mõlema DNA ahelale kõrvale uus DNA ahel, siis nimetatakse vastavat protsessi semikonservatiivseks. Helikaas - ensüüm, mis lahutab DNA ahelad üksteisest. Enamasti funktsioneeri heksameerina. SSBP ( single -strand binding protein )- seondub üheahelalisele DNA-le, hoides ära selle kaheahelaliseks muutumist. DNA replikatsiooni näol on tegemist väga täpse mehhanismiga. Nimelt, uurimuste kohaselt teeb tehakse miljon aluspaari liitmise kohta ainult üks viga, kuigi reaalselt võiks see arv olla palju suurem. Nimelt on DNA polümeraasil peale sünteesimisaktiivsuse ka ingliskeelse terminiga väljendatud aktiivsus ehk proofreading. Vigade parandamiseks on DNA polümeraasil 3´-5´ eksonukleaasne aktiivsus. Bakterirakus on kolm DNA polümeraasi- DNA polümeraas I, II ja III. Polümeraasid I ja II. DNA polümeraas III on põhiline DNA replikatsooni ensüüm. Imetajarakkudes on vähemalt 5 erinevat polümeraasi- , , , ja , ja töötavad koos ning on seotud tuuma DNA replikatsiooniga. polümeraasi ülesandeks on mitokondriaalse DNA replikatsioon. ja osalevad aga tuuma DNA reparatsioonil.
http://oak.cats.ohiou.edu/~ballardh/pbio475/Heredity/DNA-replication.JPG
Funktsioon. DNA peamiseks ülesandekson geneetilise info säilitamine ja selle korrektne ülekandmine tütarrakkudesse. Selle juures on vajalik DNA kahekordistumine ehk replikatsioon. RNA ( ribonukleiinhape )
Ehitus. RNA ehituslikeks komponentideks on viiesüsinikuline suhkur riboos, fosfaatgrupp ja lämmastikgrupp.RNA primarseks struktuuriks on lämmastikaluste järjestus, kuid sekundaarseks struktuuriks on osaline heeliks . Lämmastikalus tümiini asendab uratsiil . Ehk siis komplementaarsus on A-U ja G-C. RNA sünteesimine toimub kolmes järgus: initsiatsioon , elongatsioon ja terminatsioon. RNA polümeraasid, mis katalüüsivad transkriptsiooni on komplekssed multimeersed valgud . Erinevad RNA liigid: tRNA - transpordib aminohappeid ribosoomi mRNA- info valgu sünteesiks rRNA- ribosoomide koostisosa
Funktsioon: RNA abil toimub geneetilise info realiseerimine .
Eukarüootide RNA polümeraasid RNA polymerase I tuumake ribosomaalne RNA, välja arvatud 5S rRNA RNA polymerase II tuumake tuuma pre-mRNA-d RNA polymerase III tuumake tRNA-d, 5 S rRNA ja teised väikesed tuuma RNA-d
Transkriptsiooniks on vajalikud promooterid. Erinevate polümeraasside puhul on ka vastavad järjestused erinevad. RNA polümeraas II promootor sisaldab lühikesi konserveerunud järjestusi. Transkriptsiooni alguspunktile lähim konserveerunud element kannab nimetust TATA box, järjestus TATAAAA. Teised konserveerunud elemendid on CAAT box ja GC box. Transkriptsioonifaktorid on valgud, mis inistsieerivad või reguleerivad eukarüootsetes rakkudes trankriptsiooni. Transkriptsioonifaktorid sisaldavad DNA-ga seonduvat järjestust, mis seondub 8-15 nukleotiidi pikkuste spetsiifiliste DNA aladega ning transaktiveerivat järjestust, mis enamasti võimaldab sondumist RNA polümeraasi siduvate valkudega. Lisaks nendele aladele on transkriptsioonifaktoritel mitmeid ühiseid ehituslikke elmente ja selle alusel jagatakse :need järgnevalt: · heeliks-pööre-heeliks ( helix -turn-helix) motiiviga valgud · homeodomääni valgud · heeliks- ling -heeliks (helix- loop -helix) · "Tsinksõrme" (Zn- finger ) sisaldavad valgud · aluselised leutsiini tõmlukku (leuzine zipper) sisaldavad valgud · POU-domääni valgud · steroidhormoonide retseptorid
Inimese mitokondriaalne genoom Mitokondriaalne genoom koosneb tsirkulaarsest kaksikahelalisest DNA-st. Antud genoomi suuruseks on 16 569 bp. Jaotatakse raskeks ja kergeks ahelaks. Mitokondrid sisaldavad tavaliselt tuhandeid DNA molekule. Mitokondriaalne DNA päritakse ema liini pidi. Inimese mitokondri DNA-s sisaldub praeguste andmete kohaselt 37 geeni.
Tuuma genoom Mitokondriaalne genoom · suurus 3300 Mb 16.6 kb
· erinevate DNA 23 XX või 24 XY rakkudes, üks tsirkulaarne DNA molekulide arv kõik on lineaarsed molekul
· seonduvad valgud mitmed histoonid ja teised valgud suures osa valkudest vabad
· geenide arv 30 000-40 000 37
· geeni tihedus 1/90 kb 1/0.45 kb
· korduselemendid suur hulk väga vähe
· transkriptsioon enamik geenidest transkribeeritakse mitmete geenide transk- individuaalselt unikaalsetest promootoritelt riptsioon samalt promootorilt · intronid leiduvad enamikes geendes puuduvad
· kodeeriv DNA 2% 93% VALGUD
Ehitus. valgu näol on tegemist kõrgmoleklaarse ainega, mille koostisosadeks on aminohapped . Primaarseks ehituslikuks tasandiks on aminohappeline järjestus, järgnev tasand on -struktuur või - heeliks. Tertsiaarselt moodustuvad kas gloobulid või fibrillaarsed struktuurid . Kvaternaarse tasandi puhul liituvad omavahel kas gloobulid või fibriinid, võimalik ka nende omavaheline kombinatsioon. Valkude süntees kannab nimetust translatsioon . Protsess toimub ribosoomides. Ribosoomid on rakuorganellid, mis koosneb rRNA moleulidest. Eukarüoodi ribosoom (80 S) koosneb järgnevatest komponentidest: 1. väike alaüksus ehk 40S, sisaldab 18S rRNA-d ja 33 erinevat valku. 2. suur alaüksus ehk 60S, mis sisaldab 5S rRNA-d, 5.8S rRNA-d, 28S rRNA-d ja 49 erinevat valku. Neid kromosoomipiirkondi, kus toimub RNA geenide transkriptsioon, nimetatakse tuumakese piirkondadeks. Ribosoomide geenid asetsevad genoomis tandeemsete duplikaatidena, mis on omavahel eraldatud intergeensete mittetranskribeerivate speisseraladega. rRNA geenide transkribeerimise tulemusena saadakse prekursorRNA, mis allub posttranskriptsioonilisele protsessingule Funktsioon. valgud osalevad samuti geneetilise info realiseerimises. See toimub geneetilise koodi abil. Geneetilises koodis määravad aminohappe ära tripletid.
Kromosoomid Organismide genoom on suuremas osas jaotunud kromosoomidesse. T. Brown defineeib kromosoomi kui isereplitseeruvat nukleiinhappe molekuli, mis sisaldab geene. Prokarüootide kromosoomiks on rõngas-DNA molekul. Kogu prokarüoodi genoom on pakitud ühte kromosoomi. DNA on kokku pakitud mitmekümneks linguks, mida hoiab koos RNA. Valkude abil kinnituvad DNA lingud basaalse alaga bakteriraku sisemembraanile, moodustades nukleoidi ala. Eukarüootidel on nukleoomse struktuuriga kromosoomid, mis asuvad rakutuumas ja on tsütoplasmast eraldatud tuumamembraaniga. Lisaks tuumagenoomile on veel tuumaväline mitokondrigenoom, millele taimede ja mõnede vetikate puhul lisandub kloroplastigenoom. Kromosoomide koostisse kuuluvad DNA, RNA ja valgud. Kromosoomistikku iseloomustab kromosoomide kuju, mille määrab primaarsoonise ehk tsentromeeri asukoht. Selle alusel eristatakse telo-, akro-, submeta- ja metatsentrilisi kromosoome. Metatsentriku tsentomeer jagab kromosoomi kaheks enam-vähem võrdseks õlaks. Telotsentriku tsentromeer paikneb aga telomeeri piirkonnas ja kromosoomil on visuaalselt eristatav vaid üks õlg. Inimesel esineb karüotüübis nii meta -, submeta- kui ka akrotsentrilised kromosoomid. Kõrgemalt arenenud liikidel on rohkem asümmeetrilisi kromosoome. Tuuma DNA hulk on määratud liigi kromosoomide arvu ja suurusega. Igal liigil on genoomis kindel hulk DNA-d ja seda suurust nimetatakse C-väärtuseks. Antud suurus võib olla väljendatud nii pikogrammides kui ka aluspaarides. On täheldatud, et DNA hulk varieerub lähedastel liikidel väga suures skaalas ja samas suur sarnasus morfoloogiliselt väga erinevate ja süstemaatiliselt kaugete liikide vahel. Seda nähtust nimetatakse C-väärtuse paradoksiks. Eukarüoodi DNA-seoselised valgud jagunevad kaheks- histoonid ja mittehistoonsed valgud. Mõlemat tüüpi valkude kompleksid tuuma DNA-ga moodustavad kromatiini . Histoone nimetatakse ka kromosoomi struktuurvalkudeks, ülejäänud on regulatoorsed valgud. Histoonid sisaldavad palju positiivselt laetud aminohappeid arginiini ja lüsiini. Sellest tulenevalt on histoonid aluselised. Positiivne laeng aitab histoonidel DNA-ga seonduda. Eristatavad on 5 põhilist histoonide klassi: H2A, H2B, H3 ja H4 kuuluvad nukleosoomi koostisesse; histoon H1 asub linker -DNA alas . Protamiinid on tugevalt aluselised valgud, mis on ehituselt histoonidest lihtsamad ning ei sisalda türosiini. Protamiinid asendavad histoone spermides, võimaldades DNA väga tugeva kokkupakkimise. Histoone määravad geenid asuvad eükarüootide genoomis tandeemsete kordustena. Mittehistoonsete kromosoomivalkude hulka kuuluvad DNA topoisomeraasid, HMG valgud, teatud DNA-ga järjestsspetsiifiliselt seonduvaid valke, RNA polümeraasid, DNA süntetaasid ja proteiinkinaasid. Ensüüm topoisomeraas I ülesandeks on keerata lahti DNA keerd , tehes enne lõike ühte ahelasse. Topoisomeraas II lõhub kaheahelalise DNA, võimaldades DNA lahtikeerrumise parandab lõikekoha ehk siis katalüüsib DNA heeliksi pöörduvaid katkemisi. Eukarüootide kromosoomides on DNA umbes 1200-kordselt kokku pakitud. Kromatiini pakkimise ühikuks on nukleosoom . Nukleosoom koosneb umbes 200 bp pikast DNA lõigust ja histoonsest oktameerist. Viimase moodustavad histoonid H2A, H2B, H3 ja H4, kusjuures igaühte on genoomis 2 molekuli. Umbes 140 bp DNA-st keerdub kaks korda ümber histoonse südamiku, ülejäänud DNA on linker-alas. 2 nm diameetriga DNA kaksikahela keerdumisel ümber histoonse oktameeri moodustub 10 nm kromatiinniit. Kromatiinniit moodustab H1 histooni osalusel 30 nm kromatiinkiu. Järgnevalt, nukleosoomne kiud moodustab spiraalse konformatsiooni- solenoidi . On ka mudeleid, mille kohaselt on solenoidi asemel hoopiski dinukleosoomne spiraalne lint. 1989. aasta Pienta mudeli järgi organiseeruvad solenoidid lingudeks. Ling on tõenäolisemalt DNA kõrgemat järku struktuuri põhiühik, eksisteerides kogu rakutsükli vältel nii spermides kui ka diploidsetes tuumades. Kromatiini kokkupakkimisel ja geeniekspressiooni regulatsioonil on olulised nii histoonide atsetüleerimine kui ka fosforüleerimine. Histoonide fosforüleerimise eest vastutab proteiin kinaas . Komosoomide kondenseerumine on seotud selliste valkudega nagu XCAP-C ja XCAP-E. Lisa-ehk B-kromosoomid Igat liiki iseloomustab kindel kromosoomistik, niinimetatud A-kromosoomid. A-kromosoomide mutatsioonid viivad geneetilise tasakaalu rikkumisele ja on reeglina kahjulikud. Paljudel taime-ja loomaliikidel (mitte inimesel) võivad karüotüübis esineda ka B-ehk lisakromosoomid, mis on suures osas heterokromatiinsed ja mille vähest eukromatiini ei transkribeerita. B-kromosoomid on tavaliselt väiksemad kui A-kromosoomid ning nende arv ja kuju varieerub ühe liigi isenditel ja ka ühe isendi erinevates rakkudes. B-kromosoomide olemasolu karüotüübis võib paljudel liikidel viia kiasmide sageduse tõusule A-kromosoomides, suurendades geneetilist rekombineerumist ja ka varieeruvust järglaste hulgas. B-kromosoomid replitseeruvad S-faasi lõpus, kusjuures rakutsükkel pikeneb vastavalt lisakromosoomide arvu suurenemisele.
Kromosoomide spetsialiseerunud alad- · soonised ehk heledamini värvunud alad- primaarsoonis ehk tsentromeer jagab kromosoomi kaheks õlaks. Sekundaarsoonis on soonis, mis pole seotud tsentromeeriga ja avaldub kui heledalt värvunud ala kromosoomis. · satelliidid- sekundaarsoonistest distaalselt asuvad alad. · telomeerid - kromosoomiotsad ehk terminaalsed alad. · kromomeerid- tumedad vöödid, mis tekivad kromatiinniidi keerdumise tagajärjel. Neid võib näha meioosi profaasis tumedate vöötidena. · kromosoomivöödid- heledamini ja tumedamini värvunud alade vaheldumine piki kromosoomi. Kromosoomivöödistud saadakse diferentsiaal - ja selektiivvärvimise tulemusena või taimede puhul näiteks ka temperatuuriga mõjutades. Kromosoomide duplitseerumiseks ja repltseerumiseks on vajalik element replikatsiooni lähtepunkt ehk origin . Origin on defineeritud kui DNA lõik, mis on vajalik ja piisav DNA replikatsiooni tagamiseks. Replikatsiooni origin peab sisaldama autonoomselt replitseeruvaid järjestusi ehk ARS- e. Kui prokarüootide genoomis on tavaliselt üks origin, siis eukarüootides algab replikatsioon paljudest kohtadest korraga. Tsentromeer ehk cen on kromosoomipiirkond, mis koosneb erinevatest DNA kordusjärjestustest, millega seonduvad tsentromeerivalgud. Tsentromeer vahendab kromosoomide kinnitumist mitootilise või meiootilise käävi külge, osaleb kromosoomide liikumisel poolustele ja hoiab koos tütarkromatiide. Tsentromeeri DNA koosneb lühikestest, enamasti alla mõnesaja aluspaari pikkustest lõikudest, mis on miljoneid kordi tandeemselt korratud. Osas tsentromeerides esineb lihtne järjestus (GGAAT)n, mida peetakse tsentromeerseks konserveerunud järjestuseks. Inimesel paiknevad kõigi kromosoomide tsentromeerses alas alfa. satelliit -DNA järjestused, mis on 171 bp pikad ja korratud umbes 5000 korda. Kõige paremini iseloomustatud kromosoomivalkudeks on CENP-A, CENP-B ja CENP-E. Kinetohoor on mitmekihiline valguline paaris-struktuur, mis moodustub jagunevas rakus tsentromeeri külge, ehk siisala, millele kinnituvad käävi mikrotuubulid. Kinetohoorid sisaldavad mikrotuubuli mootorvalke ja rakutsükli regulaatorvalke. Kinetohooride vahendusel seonduvad replitseeruvad kromosoomid vastaspoolustele, kinetohoorid aitavad kromosoomidel käävis õigesti paigutuda ja hoiavad ära kromosoomide lahknemise enne, kui kõik kromosoomid on kinnitunud ja õigesti asetsenud. Kinetohoor on kolmekihiline struktuur, mis paikneb kahe kromosoomiõla struktuurse heterokromatiini vahel. Tsentromeerialade analüüs Struktuurse heterokrmatiini alasid saab kromosoomides esile tuua C-vöötide meetodil, töötlemisel restriktaaside või antikehadega ning fluorestsentsanalüüsil. Barri kehake: selle moodustab üks kahest X-kromosoomist. Barri kehakest võib leida naise teatud kudedes interfaasi rakkude tuumades, näiteks neeru, maksa ja limaskesta epiteeli diploidsetest rakkudest. Telomeer on kromosoomide otstes asuv järjestus. See hoiab ära DNA degradeerumise ehk lagundamise nukleaaside ja kromosoomide omavahelise ots-otsaga liitumise . Kromosoomiotsad sisadavad kaht tüüpi järjestusi: lihtsad telomeersed järjestused ja telomeeriga assotsieerunud polümorfsed järjestused. Telomeerne DNA järjestus on 6-8 bp pikk ja tadeemselt korratud mitusada kuni tuhandeid kordi. Inimese telomeeris kordub tandeemselt järjestus TTAGGG. See järjestus on arvatavasti olemas kõigil selgroogsetel kromooomidel. Kuna telomeer lüheneb DNA sünteesil DNA primaasi mõjul, siis kromosoomi pikkuse säilitamiseks on vajalik pidev telomeersete järjestuste lisamine. Pikenemine toimub RNA-d sisaldava telomeraasi ehk telomeeri terminaalse transferaasi abil, mis lisab kordusi 3 ´otsale. Telomeraasi RNA molekulil on telomeerse DNA-ga lühike komplementaarne ala, mis täitab matriitsi rolli telomeersete järjestuste sünteesil. Kõrgematel organismidel hakkab telomeraas represseeruma kohe peale sündi. Nii hakkavad telomeerid lühenema ja see protsess kujutab endast mitootilist kella. Telomeraasi reaktiveerumine võib aga viia vähi tekkele. Telomeeri valke on kirjeldatud kümmekond. Neist osa seaondub vaid telomeerse DNA tipmisele osale, teised aga kogu telomeersele DNA-le. Telomeersed valgud moodustavad telomeerile nii-öelda kaitsva mütsi. Telomeeri valgud reguleerivad telomeeri pikkust, aitavad kaasa antud järjestuse pakkimisele ja vahendavad TTAGGG korduste kinnitumist tuuma maatriksile. Telomeeri kromatiini struktuur mõjutab ka telomeeriga külgnevae geenide ekspressiooni, mistõttu telomeeri vahetus läheduses on geenid sageli represseeritud. Tuumakese organisaatori piirkond ehk NOR Tuumakese organisaatori piirkond on kromosoomiala, mis moodustab tuumakese. NOR-is paiknevad rRNA tandeemselt korratud geenid. Iga rDNA transkriptsiooniühik sisaldab rRNA geene kodeerivaid järjestusi ja mittetranskribeeritavat intergeenset speisserit. Inimese 5S RNA geenid, mis on 120 bp pikad ja mitusada korda tandeemelt korratud, paiknevad 1. kromosoomi pikal õlal ja ei ole seotud tuumakesega. 18S, 5.8S ja 28S rRNA geenid on 44 bp pikad ja paiknevad akrotsentriliste kromosoomide 13-15 ja 21-22 NOR-alades.
DNA kordusjärjestused
Kordusala Korduse Korduse arv Kordusühik Lookuste arv Lokalisatsioon tüüp Satelliit DNA tandem 10 3-107 1-103 bp Väike (1-2 struktuurses kroosoomi heterokromatiin kohta) is Minisatelliit tandem 10-103 15-100 bp mõni tuhat geenide (VNTR) genoomis vaelistes alades, telomeerides geenide vahelistes alades (ka geenides) Mikrosatelliit tandem 1-6 bp üle genoomi Geenide (STR) vahelistes alades Hajuskordus üksik (IRS) SINES 105-106 150-300 bp üle genoomi R-vöötides LINES 104-105 1.5-6 kb üle genoomi G-vöötides DNA lateraalsed kordused Polüteniseerumine on endoreduplikatsiooni modifikatsioon , misläbi tekivad polüteensed kromosoomid. Polüteenseid kromosoome on kirjeldatud nii ainuraksetel, taimedel kui ka loomadel. Neid esineb süljenäärmete rakkudes, Malpighi rakkudes, ovariaalsetes toiterakkudes, naha-ja sooleepiteelis, trofoblasti rakkudes ja taime endospermi rakkudes. Polüteensed kromosoomid on üle saja korra suuremad kui metafaasi kromosoomid. Polüteensed kromosoomid tekivad kromatiidide korduva replikatsiooni tagajärjel rakutsükli S-faasis. Kromatiidid jäävad kokku ja paarduvad. Tuuma ja raku jagunemist ei järgne. Tihedalt kokku pakitud kromomeersete alade reastumisel üksteise kõrvale moodustuvad tumedad vöödid.
Kromoosomikaardid Geneetilised kromosoomikaardid: antud kaart kujutab endast aheldatud geenide vastastikust paiknemist piki kromosoomi. Geenide suhtelist kaugust üksteisest arvutatakse rekombinatsioonide sageduse kaudu ja väljendatakse sentimorganites ehk morganiidides. Mida kaugemal asuvad geenid üksteisest, seda suurem on nendevahelise ristsiirde tõenäosus. 1 cM (sentimorgan) on suhtelin kaugus kahe geeni vahel, mille rekombinatsioonisagedus ristsiirdel on 1 %. Rekombinatsioonisagedus ei ole stabiilne suurus, see varieerub ka sama organismi erinevate kromosoomide puhul. Füüsilised kromosoomikaardid: jagunevad molekulaargeneetilisteks ja tsütogeneetilisteks. Tsütogeneetiline kaart näitab tsentomeeri, sekundaarsooniste, kromomeeride, eu-ja heterokromatiinivöödi asukohti. Molekulaargeneetilised kaardid on kromosoomi füüsikalis-keemilise analüüsiga määratudjärjestustüübid, ensüümide toimepunktid, geenid ja geenivahemikud. Pikkusi ja suurusi mõõdetakse nukleotiidipaaride arvuga.
Kromosoomianalüüs Kromosoomiuuringu meetodid
In vivo mittejagunevad rakud . Antud olukorras saab kromosoome uurida interfaasi tuumades. Klassikaline materjal selleks on kahetiivaliste vastsete süljenäärmete polüteensed kromosoomid. Interfaasi kromosoomid on reeglina dekondenseerunud, pikemad kui metafaasi kromosoomid ja sassis. Seetõttu ei saa neid tavaliste meetoditega uurida. Antud kromosoome on võimalik uurida, kombineerides uusi tehnoloogiaid ja FISH-tehnoloogiat. In vivo jagunevad rakud. Tavaliselt analüüsitakse kromosoome mitoosi metafaasi staadium. Kuid seda uuringut saab teostada somaatilistes kudedes, kus on jagunevaid rakke, meioosi kromosoome aga generatiivses koes. Inimese kromosoome saab kultiveerimata uurida luuüdi rakkudest, koorioni hatulisest trofoblastist, kasvajakoest, testikulaarsest ning ovariaalsest koest. In vitro jagunevad rakud. Mitmete kromosoomianalüüsiks sobivate kudede rakud on lõpuni diferentseerunud ja jagunemise lõpetanud. Sel juhul viiakse kromosoomianalüüs läbi in vitro kultiveeritud ja jagunema stimuleeritud rakkudes. Imetajatel uuritakse kromosoome peamiselt perifeerse vere lümfotsüütides. Kasutatakse kas täisverd või isoleeritud lümfotsüüte. Rakke stimuleeritakse jagunema taimsete lektiinidega. Enamkasutatavaks T-rakkude spetsiifiliseks lektiiniks on türgioa seemnetest eraldatud fütohemaglutiniin (PHA). Esimesed mitoosid ilmuvad 38-40 tundi peale stimuleerimist, maksimaalset proliferatsiooni võib täheldada 72-96 tunni möödudes. Tavaliselt kasutatakse 68-72 tunni kultuuri ja analüüsitakse teist või kolmandat mitoosi. Sünnieelses diagnostikas kasutatakse kultiveeritud amnioni - ja koorionirakke. Nii täiskasvanu kui embrüo rakud kasvavad kultuuris vaid piiratud aja. Selleks, et rakke kauem kasvatada, tuleb need immortaliseerida. Püsirakuliine saadakse kas spontaanset immortaliseerunud kasvajarakkudest või keemiliste ainete, kiirguse ja viiruste tomel transformeerunud rakkudest. Tuleb aga arvestada, et pikaajalisel kultiveerimisel mutub rakupopulatsioon aina heterogeensemaks ja rakud polüploidiseeruvad.
Kromosoomipreparaadi saamine Kromosoomipreparaadi saamiseks töödeldakse rakke järgnevalt: · ihibeeritakse mitoosi kääv · töödeldakse hüpotoonilise lahusega · fikseeritakse · tehakse kromosoomipreparaat · värvitakse Käävi inhibeerimine. Rakkude jagunemise peatamiseks metafaasis kasutatakse enamasti sügislillest (Colchicum autumnale) saadud alkaloidi kolhitsiin ja selle sünteetilist derivaati koltsemiidi. Mitoosi käävi inhibeerimiseks kasutatakse veel taimest Vinca saadud vähivastaseid ravimeid vinblastiin ja vinkristiin. Hüpotooniline töötlemine. Hüpotoonilise lausena kasutatakse 0.56% kaaliumkloriidi või 0.8% naatriumtsitraadi lahust. Kui rakud viia hüpotoonilisse lahusesse, siis võtavad need soolade kontsentratsiooni ühtlustamiseks väliskeskkonnast vett ja paisuvad . Kuna profaasis on tuumamembraan lagunenud ja mitoosi kääv tänu kolhitsiinile depolümeriseerunud, siis saavad kromosoomid paisuvas rakus vabalt liikuda . Fikseerimine. Rakke fikseeritakse metanooli ja jää-äädikhappe segus vahekorras 3:1. Metanool denatureerib ja sadestab valgu, äädikhape aga koaguleerib nukleoproteiini. Kromosoomipreparaadi tegemine. Preparaadi valmistamisel tilgutatakse fikseeritud rakususpensioon puhastatud märjale alusklaasile ning kuivatatakse kas õhus või leegil. Niiskes keskkonnas on kromosoomid pehmed , kuid muutuvad kõvaks kohe peale kuivamist. Pehmed kromosoomid on väga elastsed, eriti kui neid on väga lühikest aega fikseeritud. Elastseid kromosoome on võimalik faaskontrastmikroskoobi all mitu korda pikemaks venitada nagu kummipaela. Niiskes keskkonnas läbi viidud kromosoomide pikendamist nimetatakse kromosoomide venitamiseks ehk sirutamiseks (chromosome stretching ). Kõige lihtsam on kromosoome värvida tavavärvimise meetodil Giemsa värviga. Töötluse tulemusena kromosoomid ei vöödistu, vaid värvuvad ühtlaselt. Kõige rohkem kasutatakse Giemsa värvi, mille koostisesse kuuluvad happeline eosiin Y ning aluseline metüülsinine ja thaziinvärv azuur B. Värv muudab kromatiini lillakaspunaseks. Giemsa-kompleksil on üks negatiivne ja kaks positiivset langut. Positiivselt laetud molekuli osa inerakteerub negatiivselt laetud DNA-ga, samas kui negatiivselt laetud osa seostub histoonidega.
Kromosoomivöödid Kromosoomivööt ehk bänd on kromosoomiala, mis naaberaladest eristub, olles heledam või tumedam . Kromosoomivöödistus tekib lineaarselt külgnevate heledate ja tumedate vöötide vaheldumise tõttu. Lisaks vöötidele eristatakse kromosoomimustris veel rajamärke, mille all mõeldakse selgelt eristatavaid ja kromosoomi identifitseerimisel olulisi morfoloogilisi alasid. Rajamärkide hulka kuuluvad telomeerid, tsentromeer ja suured iseloomulikud vöödid. Regiooniks nimetatakse kromosoomipiirkonda kahe rajamärgi vahel. Vöödistude tasemed . Kui rakendada kromosoomidel Q-, G- või R-vöödistust, siis saab inimese kromosoomistikus umbes 300-400 vöödi lahutuse. Pro- ja prometafaasi kromosoomides diferentsiaalvärvimise tulmusena saadud vöödistusi nimetatakse kõrglahutusvöödistuseks, HRB ehk kõrglahutus-tsütogeneetikaks, HRC. Maksimaalne lahutus on 1000-1250 vööti genoomi kohta. Üks vööt sisaldab tavaliselt 2-5 Mb DNA-d.
Eukromatiini diferentsiaalvärvimine Eukromatiini värvimiseks on Q-, G- ja R-vöötide meetodid. Q-vöötide meetod töötati välja 1968. aastal. Selle meetodi puhul värvitakse kromosoome lühiajaliselt fluorokroomiga ja analüüsitakse seejärel fluorestsentsmikroskoobis. Töötluse tulemusena vahelduvad alad tuhmi hiilgusega aladega. G-vöötide meetod ehk GTG-meetod töötati välja 1971 .aastal Seabright´i poolt. Meetod hõlmab endas kromosoomide lühiajalist mõjutamist trüpsiiniga ja värvimist Giemsa värviga. Piki kromosoomi saadakse tumedate ja heledate vöötide muster, mis langeb kokku Q-vöötide hiilgavate ja tuhmide alade vaheldumisega. Arvatakse, et vöödistus tuleneb kromosoomide erinevast kokkupakkimisastmest. R-vöötide meetod ehk RFA- või RHG-meetod töötati välja 1971. aastal Dutrillaux ja Lejeune poolt. R-vöödid on vastupidised Q- ja G-vöötidele. R-vöötide saamiseks on kaks erinevat võimalust: 1. RFA-meetod: preparaate inkubeeritakse 85ºC juures fosfaatpuhvris, värvitakse akridiinoranziga ja analüüsitakse fluorestsentsmikroskoobis. Punased kromosoomivöödid vahelduvad rohelistega. Akridiinoranz värvib üheahelalise DNA punaseks ja kaheahelalise roheliseks. 2. RHG-meetod: preparaate inkubeeritakse lühiajaliselt fosfaatpuhvris 85ºC juures ja värvitakse Giemsa värviga. Analüüsitakse tavalises mikroskoobis. Töötluse tulemusena vahelduvad heledad alad tumedatega.
Heterokromatiini esiletoomine kromosoomides Kõrgematel organismidel moodustab struktuurne heterokromatiin umbes 10% genoomist ja jaotub karüotüübis kindla mustri järgi. Neid alasid saa kromosoomides esile tuua C-vöötide meetodil, töötlemisel restriktaasidevõi atikehadega või fluorestsentsanalüüsil. Kuna kõik need meetodid toovad sageli välja tsentromeeri piirkondades asuva heterokromatiini, siis nimetatakse vastavaid alasid ka C- vöötideks. C-vöötide meetod ehk CBG-meetod (C-vöödid baariumhüdroksiidi ja Giemsa värviga). Meetod hõlmab endas denatureerimist leelisega, järgnevat inkubeerimist 65ºC juures ja värvimist Giemsa lahusega. C-vöödistusega värvuvad valikulkiselt struktuurse heterokromatiini alad nii metafaasis kui ka interfaasi tuumas. C-vöödid on päranduvad kromosoomielemendid. Restriktsiooni endonukleaas/ Giemsa meetod sisaldab endas kromosoomide fikseerimist metafaasis metanool/jää-äädikhappega ja töötlust Dnaasidega. Töötluse tagajärjel tekib C-vöödi sarnane muster. DA/ DAPI fluorestsentsanalüüs. Kui inimese kromosoome värvida ainult DAPI-ga (4´-6-diamidino-2- fenüülindool), siis näeb lisaks Q-vöödistusele sarnase mustri ka suuri briljantselt hiilgava heterokromatiini blokke, kuid seda vaid 1. ja 16. kromosoomi puhul. Kui kromosoome värvida disramütsiin A-ga ja seejärel DAPI-ga, siis on briljantselt hiilgavad alad näha paljudes kromosoomides. Nukleosiid- vastaste antikehadega töötlus. Meetod seisneb DNA denatureerimises UV-ga, töötlemises 5-MeC AK-ga ja FITC-iga konjugeeritud sekundaarse AK-ga töötlemises. Analüüs toimub fluorestsentsmikroskoobi abil.
Kromosoomide diferentsiaalvärvimine
Meetod uurimisobjekt I kromosoomide tavavärvimine kromosoomid II kromosoomivöödistused 1. diferentsiaalvärvimise meetodid eukromatiin · Q-vöödistus · G-vöödistus · R-vöödistus 2. Selektiivse värvimise meetodid · C-vöödistus heterokromatiin · NOR-vöödistus tuumakese organisaatori piirkond 3. Fluorokroomidega värvimine heterokromatiin 4. Antkehade kasutamine kromosoomide värvimisel heterokromatiin 5. Restriktsiooni endonukleaas/Giemsa vöödistused heterokromatiin III värvimise erimeetodid 1. kõrglahutusvöödistus prometafaasi kromosoomide 2. fragiilsaitide esiletoomine fragiilsaidid 3. õdekromatiidide eristamine kromosoomide reproduktsioon 4. repliokatsioonivöödistused kromosoomide reproduktsioon IV In situ hübridiseerimise meetodid kromosoomid
Rakutsükkel Perioodi raku elust alates mitoosist läbi interfaasi teise mitoosini nimetatakse rakutsükliks. Selleks protsessiks kuluvat aega nimetatakse generatsiooniajaks. Interfaas hõlmab sellest ajast 90 %. Interfaasi alla käivad G1, M ning G2 faas. G1 perioodil toimub ettevalmistus DNA sünteesiks, rakk kasvab ja toodab vajalikke aineid. S-perioodil toimub DNA replikatsioon ja kromosoomivalkude süntees. G2- perioodistoodetakse peamiselt käävimaterjali ja mitoosiks vajalikku ATP-d. Selleks, et jaguneda, peab eukarüootne rakk oma massi kahekordistama ning siis jagama komponendid võrdselt kahe tütarraku vahel. Massi suurendamine on pidev protsess, mis tuleneb konkreetse raku fenotüüpi määravate geenide transkriptsioonist ja translatsioonist. Rakutsükli läbimine on rangelt kontrollitud. Rakutsüklis on olemas kaks kontrollpunkti, millest edasi kulgeb rakutsükkel ainult juhul, kui eelmine faas on täiesti lõpetatud. Esimeseks kontrollpunktiks on G1 faasis nn R-punkt ja G2 faasi lõpuosas. Mõned rakkudest ei jagune üldse. Sel juhul on rakk faasis, mis on sarnane G1 faasile, kuid erinevalt sellest pole võimeline sisenema S faasi. Seda nimetatakse G0 faasiks. Eukarüootset rakutsüklit käivitav mehhanism koosneb valgukompleksidest, mida kindlas järjekorras aktiveeritakse. Rakutsükli aparaati ja rakuväliseid signaale ühendavad signaalide ülekanderajad. Mitogeensed kasvufaktorid seonduvad raku pinnal oma spetsiifiliste retseptoritega ja initsieerivad sündmuste kaskaadi, milles on kesksel kohal erinevate kinaassete ansüümikomplekside ekspressioon ja aktiveerumine. Need spetsiifilised kompleksid koosnevad kahest subühikust: regulaatorsubühikust tsükiinist ja katalüütilisest subühikust, mida nimetatakse tsükliinsõltuvaks kinaasiks (CDK). Loomaraku mitoosi reguleerivad CDK1 (CDC2) ja tsükliinid A ja B.
Mitoos Selle protsessi abil toimub keha- ehk somaatiliste rakkude paljunemine. Mitoos koosneb profaasist, metafaasist, anafaasist ja telofaasist. Profaas - algab kromosoomide kondenseerumine, kaob tuumake, toimub tsütoskeleti osaline lagundamine. Moodustub käävisüsteem. Protsessi juhivad kaks tsentrosoomi, mis liiguvad raku poolustele.Tsentrosoomide baasilt piknevad mikrotorukesed ehk kääviniidid kromatiidide tsentromeeridele. Mikrotorukeste kinnitumiseks on tsentromeeride läheduses spetsiaalsed alad- kinetohoorid. Metafaas - toimub kromosoomide lühenemine. Mikrotorukesed ja kromosoomid asetuvad raku kesktasandile. Moodustub metafaasiplaat. Anafaas - paarilised tsentromeerid eralduvad üksteisest, kääviniidid hakkavad lühenema ning tütarkromatiidid liiguvad seejuures raku eri poolustele. Telofaas- moodustuvad uued tuumakatted, tuumakesed. Kromosoomid dekondenseeruvad. Telofaasile järgneb tsütokinees ehk tsütoplasma jagunemine ja tütarrakkude teke.
Meioos Tegemist on rakujagunemise viisiga, mille käigus tekivad sugurakud, kusjuures ühest eellasest ekib neli uut rakku. Meioos koosneb reduktsioonijagunemisest ja ekvatsioonijagunemisest, mis koosnevad faasidest, mis esinevad ka mitoosis. Oluline on ka see, et kahe jagunemise vahepeal ei toimu DNA replikatsiooni. Ehk siis tähtis erinevus mitoosi ja mitoosi vahel on see, et erinevalt esimesest tekivad meioosi tulemusena haploidse genoomiga rakud. Meioosi peamised erinevuse võrreldes mitoosiga on järgnevad: · meioosi profaas kestab kaua · tuum jaguneb kaks korda järjest ning kahe jagunmise vahepeal puudub S-faas, see tähendab, et kromosoomid replitseeruvad ühel korral. · homoloogsed kromosoomid paarduvad ja orienteeruvad vastaspoolustele. · meioosi-spetsiifiline mehhanism tagab ainult ühe funktsionaalse kinetohoori moodustumise duplitseerunud tsentromeeri piirkonda. · homoloogide vahel esineb sageli ritsiire. · homoloogsed kromosoomid jagunevad tütartuumadesse. · õdekromatiidid jäävad kokku 2. jagunemise metafaasini. · kromosoomiarv väheneb kahekordselt.
1. Reduktsioon - ehk taandjagunemine Meioosi I profaas on kõige pikem meioosi staadium ning selles eristatakse 5 staadiumi: · leptoteen- selles etapis kromosoomid kondenseeruvad ja muutuvad nähtavaks. Iga kromosoom kinnitub tsentromeersete aladega tuumamembraani külge erilise kinnitusdiski abil. · sügoteen- sünaptonemaalse kompleksi moodustumine algas leptoteeni lõpus ning jätkub sügoteeni vältel. Esmalt liituvad mõlema homoloogi külge sünaptonemaalse kompleksi lateraalsed elemendid, mis koosnevad valgust ja RNA-st. Lateraalsete elementide vahele tekib tsentraalne element. Konjugeeritud homoloogseid paare nimetatakse bivalentideks ja kuna kumbki homoloog koosneb kahest õdekromatiidist, siis nimetatakse taolist struktuuri ka tetraadiks. · pahhüteen- selles etapis on sünaps täielik. Kromomeeride muster vastab mitoosi kromosoomide G- vöödistuse mustrile. Kui homoloogsed kromosoomid on kogu pikkuses aardunud, siis moodustuvad sünaptonemaalse kompleksi rekombinatiivsed sõlmed, mis kujutavad endast multiensüümkomplekse. Nendes alades toimub pahhüteenis krossingover ( ristsiire ) ehk siis homoloogsete segmentide vahetus kahe mitte õdekromatiidi vahel. · diploteen- jätkub kromosoomide kondenseerumine. Homoloogid hakkavad eralduma, jäädes kokku vaid kohtades, kus on toimunud ristsiire. Diploteeni staadiumis võib meioos peatuda . Inimese oogeneesis on loote arengu 9. kuuks kõik ootsüüdid jõudnud diploteeni staadiumisse ja seal meioos peatub (staadiumi nimetatakse siis ka diktioteeniks). Edasine meiootiline jagunemine toimub ootsüüdi küpsemse käigus tsükliliselt suguhormoonide toimel. Nii kestab diktioteen ootsüütides 12- 50 aastat. Diktioteeni kromosoomid on lambiharikromosoomid, kus toimub aktiivne RNA ja valkude süntees. · diakinees- selles staadiumis lõppeb RNA süntees, kaob kromosoomide lambihari välimus ja jätkub nende kondenseerumine. Kromosoomid eralduvad tuumamembraani küljest ning valgusmikroskoobis saab bivalendis eristada 4 kromatiidi. metafaas I- lühikeses prometafaasis kaob tuumamembraan. Järgnevalt kogunevad bivalendid metafaasiplaadile. Kahe mitoositsentri vahele moodustub mitoosikääv. Homoloogsed kromosoomid, mida kuni anafaasini hoiavad koos kiasmid, orienteeruvad juhuslikult pooluste suunas. Anafaas I- homoloogsed kromosoomid segregeeruvad. Tänu ema- ja isapoolsete kromosoomide sõltumatule lahknemisele kombineeruvad mittealleelsed geenid. Võimalike kombinatsioonide arv sõltumatu lahknemise korral on 2n. · telofaas I- eristub kaks võrdset gruppi kahekromatiidilisi kromosoome, kus igat homoloogi on üks. · Interkinees- kahe jagunemise vahel toimub kinetohooride ümberorientatsioon vasatavalt teise jagunemise tasapinnale. Kromosoomid ei reprodutseeru.
http://www.bio.miami.edu/dana/250/meiosis.jpg
· 2. Ekvatsioon - ehk võrdjagunemine. Ekvatsioonjagunemine on võrreldes reduktsioonijagunemisega kiirem. Protsess on sarnane mitoosile, kuid kromosoomiarv on haploidne ja kromosoomid on lühemad kui mitoosis.
Krossingover hõlmab sündmusi, mis viivad geneetilisele rekombineerumisele aheldunud markerite vahel. Formaalselt on ristsiire homoloogsete kromosoomide vastavate alade retsiprookne vahetus sümmeetrilise murru ja ristpidise taasühinemise tagajärjel. Ristsiirdel osalevad kaks kromatiidi bivalendi neljast kromatiidist. Eukarüootidel esineb nii mitootiline kui ka meiootilne krossingover. Ristsiire toimub komplementaarsete DNA ahelate murru ja taasühinemise läbi sünaptonemaalse kompleksi moodustumise käigus. Tüüpilises bivalendis on vähemalt üks kiasm . Arvatakse, et esimene kiasm tekib juhuslikus kohas, järgmine ei saa aga tekkida väga lähedal, sest kahe kiasmi vahel peab olema teatud vahemaa . Seda fenoeni nimetatakse kiasmi interferentsiks.