Eesmärk: Plasmiidi sisestamine bakterisse selekteerimise ja paljundamise eesmärgil. Materjalid: 5 µl Ligeeritud DNA segu Plasmiid, mis hakkame sisestama 100 µl E.coli kompetentsed Rakud, kuhu sisestame plasmiidi rakud(TOP10), kompetentsuse aste 107 kokku Steriilne tardsööde LB Kus peal oma rakke kasvatame 200ml 200 µl Ampitsilliini vesilahus 100mg/ml Selektsioonimarker 25 µl IPTG 0,8M vesilahus Värvusreaktsioon/Aktiveerib lacZ promootorit 200 µl X-gal Värvusreaktsioon 10 Arvutused: X-gal: Tahame saada 20 µg/ml ja meil on 200ml ehk 20*200=4000 µg ehk 4mg on vaja. Meil on olemas 20mg/ml lahus, selleks et saada sealt 4mg vütame 1ml/5= 200 µl IPTG: Tahame saada 0,1mM=0,0001M ehk 0,0001 = m/0,2 ja sealt saame et vaja
Meid aga huvitavad valged kolooniad. 1. Transformeerimiseks on vaja inaktiveerida ligaas. Seda tegin eppendorfis, inkubeerides 5 min 70 °C juures. 2. Kompetentseid rakke tuleb võtta jääle sulama ning 10 min pärast lisasin 20 μl rakke ligatsioonisegule. Kogu segu inkubeerisin 30 min jääl. Meie kasutasime DH5α, mille kompetentsus on 107 (see tähendab, et 1 ng-ga transformeeritud tass annab 107 kolooniat) 3. Selle aja jooksul valatakse LB + Amp + X-gal + IPTG tassid: jälle sulatatakse agarsöödet (200 ml) ning pärast 50 °C-ni jahtumist lisatakse 200 μl X-gal, 200 μl ampitsiliini ning 25 μl IPTG-d. Pärast segamist valasin homogeenne sööde õhukese kihina Peetri tassile, kus ta jäi mõneks ajaks tarduma. 52. IPTG-d on lac promootorit aktiveeriv reagent, X-gali on vaja, et bakterite elutegevuse käigus söötmes oli näha sinist pigmenti, antibiootikumi lisatakse, et oleks võimalik selekteerida välja
Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse. Lähteained: Ligeeritud genoomne DNA (6 l). TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2. E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud (valmistamist vaata lisast) Steriilne LB (lysogeny broth) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl) agar Ampitsilliini (Amp) vesilahus, 100 mg/ml IPTG (isopropüültio-beta-D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolüül-beta-D-galaktosiid), 20 mg/ml 70% Etanool. Töö käik: (1) Transformatsiooniks lahjenda saadud ligeerimissegu (6 l) TE-ga 10-30 korda (1 osa ligeerimissegu ja 9-29 osa TE-d), sega korralikult ja pipeteeri 10 l lahjendatud segu uude katseklaasi. Võtsin 3 l ligeerimissegu ja 6 l TE-d (tegin 3-kordse lahjenduse). (2) Transformatsioon: 10 l ligeeritud DNA lahjendust 9 l 3-kordset lahjendust
Insert- see fragment, mida kloonitakse. 3 Töö nr 2: Ligeeritud produktide transformeerimine E.coli rakkudesse. Lähteained: Ligeeritud genoomne DNA (6 l). TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2. E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud (valmistamist vaata lisast) Steriilne LB (lysogeny broth) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl) agar Ampitsilliini (Amp) vesilahus, 100 mg/ml IPTG (isopropüültio-beta-D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolüül-beta-D-galaktosiid), 20 mg/ml 70% Etanool. Töö käik: (1) Transformatsiooniks lahjenda saadud ligeerimissegu (6 l) TE-ga 20 korda (1 osa ligeerimissegu ja 9-29 osa TE-d), sega korralikult ja pipeteeri 10 l lahjendatud segu uude katseklaasi. 6*20-6114 l TE. (2) Transformatsioon: 10 l ligeeritud DNA lahjendust + 20 l E
temperatuuri suhtes. 3. Transformeermiseks võta 20 l kompetentseid rakke ning lisa ligatsioonisegule. 4. Inkubeeri 30 min jääl. vajalik efektiivsuse suurendamiseks keemiliselt kompetentseks muudetud rakkude puhul, kuna külmades tingimustes kinnitub DNA rakuseinale. Etapi võib jätta vahele, või lühendada, kuid see vähendab transformatsiooni efektiivsust. 5. Selle aja jooksul vala LB+Amp+X-gal+IPTG tassid 6. Heat shock: inkubeeri transfornatsioonisegu 90 sekundit 42 oC juures. järsk temperatuuritõus tekitab plasmamembraani poorid ning võimaldab DNA-l rakkudesse siseneda. 7. Tõsta tuub vähemalt 2 minutiks jääle võimaldab rakkudel pärast Heat-shocki rakumembraani taastada. 8. Lisa 500 l LB vedelsöödet (sega korralikult) 9. Inkubeeri 15 min 37oC termostaadis vajalik selleks, et rakkudel oleks aega pärast
ära kõik ilma plasmiidita bakterid) ja X-gali, mis on laktoosi analoog, vaid glükoosi asemel on indool, mis vabaneb glükosiidsideme hüdrolüüsi käigus, ning oksüdeerub ja värvub siniseks. Sööde valmistamiseks: Sulutasime LB(steriilne sööde)+Agar söödet mikrolaineahjus sulemiseni, jahtusime pidavlt segades (et ei tarduks ära) ~50 kraadini. Lisasime 200 µl X-gal, 200 µl ampitsiliini ja 25 µl IPTG-d – lac promootorit aktiveeriva reagenti Valasime sööde Petri tassile ja panime tarduma Bakteri kasvamiseks sööde peale: Suspendeerisin bakrerid topsis edadi-tagasi ning pipeteerisin tardunud söötmega Petri tassile Selleks, et bakterid asutsid ühtlaselt, panin klaaskullikesed tassile ja loksutasin. Valasin kullikesed etanooli lahusesse ja jäätsin tass inkubaatorisse üleöö kasvamiseks. 2 päeva möödudes tulin tagasi laborisse
kasvavad lihapeptoonagaril 22 oC (72h) ja 37 oC (48h) tunni jooksul. Keskkonnamikrobioloogia konspekt 2005; Tri Kolledz 15 Coli-laadsete ja fekaalsete coli-laadsete mramiseks kasutatakse piirlahjenduste ja membraanfiltrite meetodeid. Veel rakendatakse on/ei ole ehk +/- (presence/absence) teste, mis phinevad coli-laadsete bakterite omadusel lagundada teatuid substraate, mille tulemusena tekib vrviline produkt. Coli-laadsete bakterite puhul on substraadiks isopropl-.-D- tiogalaktopranosiid (IPTG) - kasutatakse .galaktosidaasi detekteerimiseks. E. coli puhul on substraadiks o-nitrofenool-.-D- galaktopranosiid-4metlbelliferl- .-D-glkouroniid (MUG)- kasutatakse .-glkouronidaasi detekteerimiseks. Tuntumad kommersiaalsed tooted on Colilert test ja Colisure. Veel kasutatakse geeniproove ja PCR meetodeid (lacZ coli-laadsed, uidA ja uidR E. coli). Siin on probleemiks kvantifitseerimine. Mitmed uurimistd on nidanud, et coli-laadsete bakterite arvukus ei ole kvantitatiivselt seotud patogeensete
annaabi.ee 
