biokeemia lipiidide reaktsioonid ja karotenoidide sisalduse määramine. (0)

Laboratoorsed tööd 2.2 ja 1.3
Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine. Lipiidide reaktsioonid.
Töö teostaja
Õpperühm
YASB21
Üliõpilaskood
Töö teostamise kuupäev
17.04.13
Juhendaja
Tiina Randla
Protokolli esitamise kuupäev
04.05.13
2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Teooria
Taimerakkude kloro- ja kromoplastides sisalduvad fotosünteesi abipigmendina karotenoidid , mis absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ja on seetõttu kiirguse täiendavaks retseptoriks .
Karoteneoidid on arvukas ühendite rühm, mis keemilise ehituse poolest klassifitseeritakse kui tetrarepenoide. Nad sisaldavad 40 süsiniku aatomit, on polüeensete ahelatega, mille ühes või mõlemas otsas on 6- liikmelised ionoontsüklid. Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen, mis on tähtsaks vaheühendiks paljude teiste karotenoidide sünteesis. Karotenoidid jagunvad kahte põhigruppi: karoteenid jaksantofüllid. Karoteenid on hapnikku mittesisaldavad molekulid, mis koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust. Ksantofüllid on hapnikku sisaldavad molekulid.
Taimedes täidavad karotenoidid lisaks valguse absorbeerimisele ja klorofülli edastamisele ka kaitsvat rolli. Nad neelavad liigse valgusenergia ja kaitsevad rakke fotokahjustuste ning vabade hapnikuradikaalide eest.
Loomsetel organismisel on neli karotenoidi: α-, β- ja γ- karoteen ning β- krüptoksantiin. Viimane neist on vitamiin A eelühendiks. β-karoteenist tekib kaks ning α-ja γ-karoteenist ning β- krüptoksantiinist üks retinaali molekul. Karotenoidide konverteerumine retinooliks toimub soole mikrofloora poolt toodetud ensüümi, karoteeni oksügenaasi toimel. Vitamiin A aktiivsust omavad lisaks retinaalile ka retinool, retineenhape ja retinooli estrid .
Vitamiin A kõige tähtsamaks ülesandeks on nägemisprotsessi tagamine, luues selleks fotokeemilise aluse. Lisaks toimib vitamiin A antioksüdandina. Ta tõkestab loomorganismides lipiidide oksüdatsiooni ja kaitseb sellega silmi kahjuliku sinise ja UV-kiirguse eest. Retinooli metabolismi käigus tekkiv retineenhape toimib transkriptsiooni regulaatorina. Ta mõjutab rakkude kasvu ja diferentseerumist. Hulkraksetes organismides on karotenoididel oluline roll rakkudevahelises suhtluses . Karotenoidid stimuleerivad valk konnektsiini ekspressiooni, mis moodustab rakumembraani aukliideseid ja mille kaudu toimub madalmolekulaarsete ühendite ning ioonide rakkudevaheline liikumine. Sellised ühendused on tähtsad rakkude diferentseerumise ja kudede homoöstaasi tagamiseks. Retinoolide liigne tarvitamine võib aga täiskasvanutel põhjustada mürgistuse nähte, rasedatel aga loote arenguhäireid.
Loomsetel organismidel tuleb karotenoidid omastada taimse toiduga, sest nad ise ei ole võimelised neid aineid sünteesima. Karotenoidide imendumiseks peavad nad vabanema taimerakkudest ning kojugeerima sapphappega.
Karoteeni isomeeridest on kõige tähtsam β-karoteen, mis looduslikest ühenditest isoleerituna esineb punakas-oranzide kristallidena. β-karoteen ei ole ei vees ega vesilahustes lahustuv. Ka polaarsetes lahustites on karoteeni lahustuvus piiratud. Küll aga lahustub ta hästi apolaarsetes orgaanilistes lahustites nagu alifaatsed ja tsüklilised süsivesinikud või nende segud . Optiline aktiivsus sel ainel puudub.
Kõik karotenoidid on värvilised, värvus varieerub kollasest kuni tumepunaseni. Mida rohkem karotenoid valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel neelab ja pikematel peegeldab, seda intenstiivsem on tema punane värvus. Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas (400-700 nm) tuleneb nende molekuli ehitusest, mida iseloomustab polüeensus: molekul koosneb pikast , konjugeeritud kaksidsidemeid sisaldavast süsivesinikahelast.
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab iseloomustada neeldumisspektri järgi. Neeldumisspekter on optilise tiheduse sõltuvus uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest. Puhtal β-karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 425, 450 ja 480 nm juures.
Kuna aga proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib neeldumisspekter muutuda ja neeldumismaksimumid võivad paikneda hoopis teistel lainepikkustel. Kui proovis sisaldub samal ajal ka klorofüll, on täheldatavad neeldumismaksimumid lainepikkuste 470 ja 630 nm juures.
Töö käik
Karotenoidide isoleerimine taimses materjalist

• Peenestatud paprikast mõõdetakse tehnilisel kaalul kaaluklaasis 0,5 g proovi.
  
• Proov eelpeenestatakse noa abil.
  
• Lõplik peenestamine tehakse uhmris .
  
• Kaalutud proov viiakse uhmrisse, lisatakse väike kogus pestud liiva ja hõõrutakse uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni.
  
• Seejärel lisatakse väikeste portsjonite kaupa veevaba Na2SO4 proovis sisalduva vee sidumiseks.
  
• Soola lisatakse niikaua, kui uhmerdatav materjal on ühtlane pulbriline mass.
  
• Pulbrilise materjaliga viiakse läbi karotenoidide ekstratsioon sobiva orgaanilise lahustiga, milleks on petrooleeter .
  
• Võetakse kuiv mõõtsilinder ning klaasfilter koos filterpaberiga.
  
• Uhmris olevale peenestatud massile lisatakse väikeste koguste kaupa petrooleetrit.
  
• Esimene kogus peab olema piisavalt suur, et põhja settinud massi pinnalt oleks võimalik lahust dekatneerida.
  
• Materjali segatakse jätkuvalt nuiaga ning lastakse sademel põhja settida.
  
• Seejärel kantakse sademe kohal olev ekstrakt teelusika abil filtrile.
  
• Sama korratakse, kuni ekstrakt sademe kohal muutub värvusetuks.
  
• Kõik ekstraktid viiakse samasse kogumisnõusse.
  
• Lõpuks määratakse kindlaks ekstrakti kogumaht ning võetakse neeldumisspekter.
  

Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs

• Neeldumisspekter määratakse spektrofotomeetriga, mis võimaldab valitud spektriosas lainepikkust muuta.
  
• Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse vahemikus 350 – 650 nm ja võrdlusena kasutatakse puhast petrooleetrit.
  
• Töötatakse klaasküvettidega, sest mõdetakse nähtava valguse osas.
  
• Spektrofotomeetri ekraanile moodustub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel näidatakse ära neel lainepikkused, kus paiknevad neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni täpsed väärtused.
  
• Spektrit analüüsitakse võrreldes uuritava lahuse neeldumisspektril esinevate neeldumismaksimumide asukohti teatmeteostes leiduvate andmetega erinevate karotenoidide neeldumismaksimumide paiknemise kohta.
  
• Tehakse järeldus, kas on tegu puhta β-karoteeniga või karotenoidide seguga .
  
• Kui on segu seguga, antakse hinnang, milline karoteeni isomeer või ksantofüll ekstraktis domineerib ning arvutatakse selle sisaldus uuritavas materjalis
  

Karotenoidi sisalduse arvutamine
Karoteeni sisalduse määramiseks uuritavas proovis kasutatakse neeldumisspektri analüüsimisel saadud andmeid: neeldumismaksimumidele vastavaid optilise tiheduse väärtusi. Arvutamisel võetakse aluseks seline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektri kõige kõrgemale tipule. Arvutus põhineb nimetatud lainepikkusele vastava absorptsiooni väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele.
Teatmekirjandused leiduvad andmed väga paljude karotenoidide ekstinktsioonikoefitsientide väärtuste kohta: 1 %-liste lahuste absorptsiooni väärtuste kohta. Seega tueb kirjandusest leida uuritavas lahuses domineerivaima karotenoidi ekstinktsioonikoefitsiendi väärtus ja kasutada seda arvutusvalemis:
A – absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile
E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient
V – ekstrakti kogumaht ml
d – kasutatud ekstrahendi tihedus
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass
1000 – tegur milligrammidele üleminekuks
Kuna minul katse ebaõnnestus ning neeldumisspektrit ei olnud võimalik võtta, otsisin kirjanduseest infot paprikas ja tema sugulastes sisalduvate karotenoidide kohta.
Karotenoidid paprikas ja tema sugulastes
Karotenoidid on üks suuremaid fütotoitainete rühmi. Parimateks karotenoidide allikakas on punased ja oranzid puu- ja juurviljad , nagu tomat , paprika , apelsin jt.olulisemad sellest rühmast on α- ja β- karoteen, lükopeen ja zeaksantiin.
Paprika koos oma sugulastega kuulub maavitsaliste sugukonda. Paprika lähimad sugulased on tomat ja baklažaan.Paprika sisaldab rohkelt β-karoteeni, mis soodustab organismil päevituse tekkimist ja valmistab naha ette kokkupuuteks päikesega. Samuti sisaldab punane paprika palju lükopeeni, mis on eriti kasulik eesnäärme probleemide vastu võitlemisel. Lükopeen vähendab ka päikese kahjulikku mõju nahale. Maavitsaliste sugukonnast sisaldab tomat kõige enam lükopeeni. Baklažaan sisaldab palju antotsüoniine, mis parandavad aju funktsiooni ning tasakaali ja võivad vähendada vähitekke riski, insulti ja südamehaigusi.
Lükopeen
Lükopeen on looduslik pigment , mis toimib kehas rasvlahustuva antioksüdandina. Lükopeen tugevdab immuunsüsteemi ja vähendab erinevate haiguste, nagu südame- ja veresoonkonnahaiguste, luuhõrenemise, teatud vähivormide ja diabeedi ohtu. Lisaks on lükopeen nahale väga kasulik: ta vähendab UV-kiirguse poolt tekitatud kahju nahale.
Kuna inimorganism lükopeeni ise ei sünteesi, saab inimene toiduga kõige paremini punastest puu- ja juurviljadest. Eriti palju on seda tomatites ja ka punases paprikas. Lükopeenirikaste toitudega ei tohiks aga liialdada. Süües kaotub lükopeen igale poole üle keha laiali ja kohtades, kus teda vaja ei ole, ladestub ta rasvkoes. Seega tuleks lükopeenirikaste toitude söömisel piirduda ühe korraga nädalas. Tomat, kui kõige lükopeenirikkab köögivili sisaldab 2573 μg lükopeeni 100 g kohta.
β-karoteen
β-karoteen on A-vitamiini eelvitamiin, millest organism sünteesib endale vajaliku koguse A-vitamiini. Samuti on β-karoteen tugev antioksüdant, mis kaitseb UV-kiirguse ja vabade hapnikuradikaalide kahjuliku mõju eest, pidurdab vanavemisprotsesse hoides ära kortsude teket. See on organismile ohutu ühend, sest tema tarbimisel ei teki üleannustamise ohtu. Ülejäägid väljutatakse organismi poolt loomulikul moel, sest β-karoteen on vesilahustuv vitamiin. Väike osa β-karoteenist siiski talletatakse naharakkudesse: see annab nahale pruunika jume. Paprika on kõige parem β-karoteeni allikas, ta sisaldab umbes 2652 μg β-karoteeni. Tomat aga sama karotenoidi vaid 449 μg 100 g kohta.
Antotsüoniin
Antotsüoniinid moodustavad lahtisi vesiniksidemetega komplekse flavoonidega, käitudes kui ko- pigmendid , mis aitavad stabiliseerida pigmente taime rakumahla happelises keskkonnas. Tavaliselt esinevad nad koos suhkrutega: glükosiididena. Suhkrut on neil vaja pigmendi stabiliseerimiseks ning see tagab lahustuvuse rakumahla vesikeskkonnas . Antotsüaniinid kaitsevad DNA terviklikkust ja sidekoe antioksüdantide taset. Samuti on antotsüaniinide rikkad toidud efektiivseks vahendiks oksüdatiivse stressi vähendamisel. Baklažaan sisaldab 678 μg antotsüoniide 100 g kohta.
Karotenoidide geograafiline ja ajalooline seos
Taimed, mille viljad sisaldavad rohkelt karotenoide kasvavad valdavalt päikesepaistelistel aladel. Tulenevalt sellest, et inimesed ekvaatoril ja piirkondades, kus paistab päike enamus aja aastas, vajavad rohkem karotenoide, mis nendnde nahka päikese eest kaitseks, kasvavad nendes piirkondades ka vajalikud taimed, mille viljad sisaldavad näiteks lükopeeni.
Eestis mujal Balti riikides ning Skandinaaviamaades elavate inimeste nahk vajab tõhusat kaitset päikesekiirguse eest, sest nahk ei sisalda piisavalt kaitsvaid pigmente. Siinsete inimeste nahk on päikese suhtes tundlikum . Me vajame toiduga taimedelt pigmente, mis kaitseksid meie nahka kahjuliku UV-kiirguse eest. Meie laiuskraadidel kasvavad päikesepaistelisel perioodil edukalt nii punane paprika, tomat kui ka baklažaan, mis kõik sisaldavad vastavaid kaitsva toimega karotenoide.
Seosed taimede kasvupaikade ning taimede vilju vajavate inimeste vahel on tunnistuseks sellele, et looduslikult vajavad inimesed vaid neid toitaineid ja fütotoitaineid, mis nende elupaigas kasvavad. Varem, kui karotenoide ja muid taimede pigmente veel täpselt ei tuntud, ei osatud ka mingeid geograafilisi seoseid leida. Tänapäeval, kui loodust on põhjalikult uuritud, on teaduslikult tõestatud, et taimede kasvupaiga ja inimeste vajaduste vahel on kindel seos, mis ajalooliselt juba paika pandud.
Kasutatud materjalid

• http://www.kliinikum.ee/attachments/article/521/Puu_ja_koogiviljad_ning_sinu_tervis.pdf
  
• http://et.wikipedia.org/wiki/Tomat
  
• http://www.toitumine.ee/public/Document1.pdf
  
• http://et.wikipedia.org/wiki/Karotenoidid
  
• http://www.hautenature.eu/blog/2012/05/mis-on-lukopeen-ja-miks-see-nahale-hea-on/
  

Lipiidide reaktsioonid
Teooria
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilises koostises on estersidemed. Lipiidid ei ole vees ega vesilahustes lahustuvad. Küll aga lahustuvad nad hästi apolaarsetes orgaanilistes solventides, nagu kloroform, tetrakloorsüsinik, benseen, eeter . Mõningal määral lahustuvad ka polaarsetes solventides nagu metanool ja etanool . Lipiidide lahustumatus vee son tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis. Lipiidid on rakumembraanide põhiliseks koostiskomponendiks nii loomsetes organismides kui ka taimsetes . Samuti on lipiididel loomsetes organismides ja mitmetes taimsetes kudedes täita energeetiline varuaine roll. Samuti on neil kaitse- ja regulatoorne funktsioon ja mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus.
Lipiide võib vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele jagada mitmeti, üldlevinud on lipiidide jagamine järgmiselt: rasvhapped , rasvad , glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad, steroidid ja terpenoidid .
Seebistumisvõime järgi võib lipiide jaotada ka seebistuvateks (rasvad, vahad, sfingolipiidid, glütserofosfolipiidid) ja mitteseebistuvates ( steroolid , prostaglandiinid, terpenoidid). Vastavalt molekuli struktuurile võib lipiidid jagada ka liht-, liit- ning tsüklilisteks lipiidideks . Lihtlipiidid on neutraalsed rasvad ja vahad, liitlipiidide rühma kuuluvad fosfo- ja glükolipiidid. Tsüklilised on alkoholide baasil moodustuvad lipiidid nagu näiteks kolesteriidid.
Rasvad on ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Loomades on hüdrofoobsed rasvamolekulid akumuleerunud rasvapooridesse ja säilitavad niiviisi toiduenergiat. Naturaalsetes rasvades sisaldub väga mitmeid nii küllastunud kui küllastumata rasvhappeid . Inimesele on eriti tähtis linool- ja α- linoleenhape , sest seda organism ei suuda sünteesida ning selle peab saama toiduga. Küllastumata rasvhapetel esinevad kaksiksidemed valdavalt cis-konfiguratsioonis, seetõttu on ahel kujult väändunud. Trans-konfiguratsioonis küllastumata rasvhapete ahelad on sik-sak kujuga ning käituvad biomembraanides sarnaselt küllastunud rasvhapetele. Sellised rasvhapped on organismis raskesti metaboliseeritavad ja on seetõttu südame-veresoonkonna haiguste riskifaktoriks.
Glütserofosfolipiidid on amfifiilsed molekulid, sest lisaks kahele rasvhappe radikaalile, mis annavad molekulile hüdrofoobsuse, sisaldavad nad ka fosforhappe jääki, mille kaudu seonduvad erinevad aminoalkoholid ja moodustud polaarne tsenter . Amfipaatsuse tõttu saavad sellised lipiidid moodustada vesikeskkonnas membraanseid struktuure.
Steroolid koosnevad steraanituumast, mis on C-3 asendis hüdroksüleeritud. Seetõttu suudavad steroolid moodustada rasvhapetega estreid: steriide. Levinum loomne sterool on kolesterool, mida leidub pea kõikide loomsete rakumembraanide koostises ning mis tagab membraanide läbitavuse ja liikuvuse. Lisaks toodetakse kolesteroolist sapphappeid, steroidhormoone ja D-vitamiini. Kuigi kõrget kolesteroolitaset on peetud südame- ja veresoonkonna haiguste riskifaktoriks, on määravaks teguriks ikkagi kolesterooli jaotumine aterogeensete ja kaitsvate lipoproteiinide vahel.
Taimerakkudes on kolesterooli sarnast rolli täitmas steroolide ehk fütosteroolide esindajad ergosterool , stigmasterool. Nad erinevad kolesteroolist ja ka üksteisest C-17 asendusrühma ehituse poolest. Fütosteroolid on inimorganismile kasulikud, sest takistavad kolesterooli imendumist.
1.3.1 Rasvapleki proov
Lipiidid lahustuvad orgaanilistes lahustites. Kandes lipiidi sisaldavat lahust paberile, moodustub lahuse aurustumisel paberile rasvaplekk : paberi läbipaistvus suureneb. Vastu valgust vaadates on rasvaplekk muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam . Katse põhjal saab järeldusi teha vaid kuiva prooviga paberit uurides, sest niiske paberi läbipaistvus on suurem ka lipiide mitte sisaldavate lahuste korral
Töö käik

• Uuritakse kahte tahket segu, millest 1 sisaldab lipiide.
  
• Kahte kuiva katseklaasi pannakse umbes 1 g tahket ainet, milles soovitakse lipiidi kindlaks teha.
  
• Mõlekasse katseklaasi lisatakse 0,5 ml atsetooni, loksutatakse.
  
• Segul lastakse settida umbes 5 minutit.
  
• Kui sademe kohale on tekkinud selge lahuse kiht, kantakse mõlemast katseklaasist klaaspulgaga tilk lahust paberile ja lastakse kuivada.
  
• Kuiva paberit vaadatakse vastu valgust ja tehakse järeldus, kumb proov sisaldas lipiide.
  

Katse tulemused
Esimene proov, mis filterpaberile kandsin , jättis rasvapleki. Teine proov ei jätnud plekki.
Järeldus
Esimene proov sisaldas lipiide, sest jättis filterpaberile rasvaplekki. Teine proov lipiide ei sisaldanud, sest filterpaberile plekki ei jätnud
1.3.2 Emulsioonitest
Emulsioonid on üks liik kahe-või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud väikeste tilgakestena teises vedelikud. Emulsioonide moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks, sest emulsioonid hajutavad hästi valgust
Rasvadele on iseloomuliik hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes. Küll aga lahustuvad nad orgaanilistes solventides. Kui sellises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda loksutada , moodustub vees emulsioon. Üldlevinud on emulsioonid toiduainete valdkonnas (piim, või) ja värvitööstuses (lateksvärvid).
Töö käik

• Võetakse kaks katseklaasi, millest ühte valatakse 2 ml etanooli ja lipiidi lahust ja teise uuritavat etanooli lahust, mis lipiidi ei sisalda.
  
• Katseklaase loksutatakse ühtlase lahuse moodustumiseni.
  
• Lisatakse mõlemasse klaasi 4 ml destilleeritud vett ja loksutatakse.
  
• Jälgitakse, kumba proovi sisaldavad katseklaasis muutub segu häguseks ja tehakse järeldus lipiidi sisaldumise kohta.
  

Katse tulemused
Esimene katseklaas esimese etanooli lahusega jäi loksutamisel ja destilleeritud vee lisamisel selgeks, mingit hägi ei tekkinud. Teine katseklaas teise lahusega muutus destilleeritud vee lisamisel ja loksutamisel häguseks
Järeldused
Kuna esimesse katseklaasi hägu ei tekkinud, ei sisalda see lahus lipiide. Teine lahus muutus häguseks, järelikult sisaldab lipiide.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks kasutatakde analoogselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga tekib pruun värvus, mis võib küll lahjeneda kuid ei kao. Küllastumata rasvhapete puhul muutub broomi lisamisel hetkeks pruuniks ja värvus kaob momentaalselt.
Töö käik

• Kolme katseklaasi valatakse 2 ml erineva lipiidi lahust kloroformis
  
• Esimesse katseklaasi palmithappe, teise taimse rasva: oliiviõli ning kolmandasse loomse rasva: searasva lahust.
  
• Kõikidesse katseklaasidesse lisakatse tilkhaaval võrdne kogus broomi lahust ja jälgitakse toimuvaid värvimuutusi.
  
• Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks broomile iseloomulik pruun värvus säilima, ülejäänud kahes klaasis toimub värvuse muutus.
  
• Tehakse järeldused uuritavate lipiidi proovide küllastumatuse kohta.
  

Katse tulemused
Esimeses katseklaasis, kus palmithappe lahus, säilib broomile iseloomulik värvus. Teises katseklaasis rapsiõli lahusele broomi lisamisel kaob broomi värvus loksutamisel. Kolmandas katseklaasis muutub broomi lisamisel hetkega lahus taas värvituks.
Järeldus
Kuna esimeses katseklaasis broomi värvus ei kadunud, on palmithappe lahus küllastunud, kaksiksidemeid selles rasvhappes ei esine. Palmithape ei sisalda ka tegelikult kaksiksidemeid. Et taimsel rapsiõli lahusel kaob pruun värvus loksutamisel, esineb temas mingil määral küllastamatust, kuid on siiski küllastunud rasvhape . Kirjanduse andmetel ei tohiks taimne rasv kaksiksidemeid sisaldada . Katse põhjal saab aga väita, et rapsiõli lahuses esineb mingil määral kaksiksidemeid. Loomsel searasva lahuses kaob pruun värvus koheselt, see tähendab, et tegu on küllastamata rasvhappega. Nii katse kui ka teoreetiline osa väidavad, et loomne searasv sisaldab kaksiksidemeid ning tegu on küllastamata rasvhappega.
1.3.5 Liebermann-Burchard’i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe juuresolekul moodustub tume sinakas-roheline reaktsioonisegu. Reaktsioon on mitmeastmeline ning lõplik värvus kujuneb üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil tuvastatud kuni 20 reaktsiooniprodukti, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset palju transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõpuks tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. Kolesterooli struktuuris postitsioonis C-17 paiknev süsinikradikaal aga reaktsioonis ei osale.
Töö käik

• Kolme katseklaasi valatakse 2 ml erinevate lipiidide lahust.
  
• Esimesse kolesteroolilahust, teise oliiviõli ja kolmandasse või lahust.
  
• Igasse katseklaasi lisatakse 6-7 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning loksutatakse hoolikalt.
  
• Jälgitakse toimuvaid värvuse muutusi ja reaktsioonisegu lõpliku värvuse kujunemist.
  
• Tehakse järeldused kolesterooli sisalduse kohta uuritavates proovides.
  

Katse tulemused
Esimene katseklaas kolesterooli lahusega värvub äädikhappe anhüdriidi ja väävelhappe lisamisel sinakaks. Teine katseklaas, kus oliiviõli lahus muutub kollakaks. Kolmas katseklaas või lahusega värvub samuti sinakaks.
Järeldus
Katse näitas, millised lahused sisaldavad kolesterooli. Esimene katseklaas, kus kolesteroolilahus ja kolmas katseklaas, kus või lahus värvusid väävelhappe juuresolekul äädikhappe anhüdriidi lisamisel sinakaks, mis ongi kolesterooli esinemise kinnituseks . Samas, kolesterooli reaktsioon äädikappe anhüdriidiga väävelhappe juuresolekul peaks olema mitmeastmeline, ning lõplik produkt peaks kujunema üle punase ja sinise vaheühendi. Katses aga punast värvust näha ei olnud. Teises katseklaasis olev taimse rasva lahus, oliiviõli, ei sisalda katse põhjal kolesterooli, sest värvus kollaseks.