Karotenoidid ja lipiidid (1)

2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Teooria Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides, aga ka mõningates teistes fotosünteesivates organismides sisalduvad fotosünteesi abipigmentidena karotenoidid , mis absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ning on seetõttu täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Keemilise ehituse pooleks klassifitseeritakse karotenoide kui tetraterpenoide (40 süsiniku aatomit). Karotenoidide kaks põhigruppi on: Karoteenid ­ koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust, ei sisalda hapnikku (-, -, -, -, - jt isomeerid, lükopeen) Ksantofüllid ­ sisaldavad hapnikku (luteiin, zeaksantiin jne)
Taimedes on karotenoididel ka kaitsefunktsioon ­ nad neelavad liigset valgusenergiat ja kaitsevad rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A provitamiiniks (eelühendiks). Enamus toiduga seedekulglasse sattunud karotenoididest allub soole mikrofloora poolt produtseeritava ensüümi karoteeni oksügenaasi toimele ja neist moodustub vitamiin A.
Karoteeni -, - ja -isomeeridest omab suurimat tähtsust - karoteen (punakasoranz), mille molekul loomorganismis poolestub, andes 2 retinooli ehk vitamiin A1 molekuli.
Kõik karotenoidid on värvilised, värvus varieerub kollasest üle oranzi kuni tumepunaseni. Punane värvus on seda intensiivsem, mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel.
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi. See kujutab endast optilise tiheduse sõltuvust uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest.
Käesoleva töö eesmärgiks on karotenoidide eraldamine taimsest materjalist, saadud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel uuritava materjali karotenoidse
1 koostise analüüsimine ja iseloomustamine ning domineeriva karotenoidi kontsentratsiooni määramine.
Töö käik Tomat peenestati ning kaaluti sellest materjali 1 g. Lõplikuks peenestamiseks hõõruti väljakaalutud proov uhmris vähese pestud liiva lisandiga, kuni saavutati ühtlane mass. Vähehaaval lisati vee sidumiseks veevaba Na2SO4, kuni uhmerdamisel moodustus kuiv pulbriline mass.
Järgnevalt varustati 25 ml mõõtsilinder lehtriga ning sellele asetati paberfilter. Ekstraheerimiseks lisati uhmris olevale peenestatud massile väikeste koguste kaupa petrooleetrit, sademel lasti põhja settida ning selle kohal olev ekstrakt kanti teelusikaga filtrile. Seda korrati, kuni sademe kohale tekkiv ekstrakt muutus värvusetuks.
Ekstrakti uuriti spektrofotomeetril, võttes lainepikkuste vahemikuks 350-650 nm.
Tulemused
Neeldumismaksimumid:
1. 364 nm ; D=0,271 A 2. 443,5 nm ; D=0,582 A 3. 468 nm ; D=0,749 A 4. 499 nm ; D=0,603 A
Kirjanduse alusel domineerib karotenoididest lükopeen (505, 472, 446)
Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile:
A ­ absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile max
2 E1cm 1% - 1% lükopeeni lahuse ekstinktsioonikoefitsient lainepikkusel 472 nm
V ­ ekstrakti kogumaht , ml
d ­ kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3
g ­ uurimiseks võetud taimse materjali mass, g
103 ­ tegur milligrammidele üleminekuks
Katse tulemus näitab, et tomatis sisaldub karotenoididest kõige enam lükopeeni. Kirjanduse andmetel sisaldab 1 g tomatit ~0,026 mg lükopeeni. Katse tulemus annab sisalduseks ~0,012 mg. (mg% näitab lükopeeni protsendilist sisaldust milligrammides)
1.3 Lipiidide reaktsioonid
Teooria Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersidemete esinemine. Tavaliselt ei lahustu lipiidid vees ega vesilahustes, vaid apolaarsetes orgaanilistes lahustites (triklorometaan, benseen , eeter jt) ning vähesel määral ka polaarsetes lahustites ( metanool , etanool jt). Vees lahustumatus on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis.
Lipiidide üldlevinuim rühmitus:
rasvhapped rasvad glütserofosfolipiidid sfingolipiidid vahad steroidid terpenoidid
1.3.1 Rasvapleki proov Kõikide lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub paberile rasvaplekk, mis on vastu valgust vaadates muust paberist heledam, paberi läbipaistvus on suurenenud.
Töö käik Kahte kuiva katseklaasi pandi ~1g kummastki proovist, milles sooviti lipiidide olemasolu kindlaks teha. Lisati ~0,5 ml atsetooni , loksutati ning tahkel materjalil lasti settida. Mõlemast katseklaasist kanti pipetiga tilk lahust filterpaberile. Kui paber oli kuivanud, vaadeldi seda vastu valgust ning varju.
3 Tulemus Proovi nr 2 sisaldava lahuse plekk oli vastu valgust heledam ning vastu varju tumedam , paberi läbipaistvus oli suurem. Proovi nr 1 lahuse plekil muutusi märgata ei olnud. Seega sisaldas proov nr 2 lipiide .
1.3.2 Emulsioonitest Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises. Emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni lahuse hägustumine.
Kui orgaanilises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda, siis intensiivsel loksutamisel moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .
Töö käik Kahte kuiva katseklaasi valati ~2 ml 96% etanooli ning lisati 2 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest ühes sisalduvad lipiidid. Loksutati, lisati 4 ml destilleeritud vett ning loksutati veel.
Tulemus Proovi nr 1 sisaldavas katseklaasis muutus segu loksutamisel häguseks, seega proov nr 1 sisaldas lipiide.
1.3.3 Akroleiiniproov Glütserooli kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga küllastumata aldehüüd propenaal ( akroleiin ). Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfolipiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid. Akroleiini moodustumise järgi saab eristada glütserooli sisaldavaid ja mittesisaldavaid lipiide.
O t° H2C HO OH + 2H2O
OH H glütserool e propaantriool akroleiin e propenaal
Töö käik Kahte kuiva katseklaasi pandi ~1g NaHSO4 ja lisati mõni tilk kummastki uuritavast proovist. Katseklaase kuumutati tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulamiseni ning proovi tumenemiseni, mis annab märku akroleiini moodustumisest.
Tulemus Proovi nr 1 sisaldavas katseklaasis olev segu muutus kuumutamisel esimesena tumedamaks, see tähendab et proovis nr 1 sisalduva lipiidi koostises on glütserooli, proovis nr 2 mitte.
4 1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides Küllastumata rasvhapete kindlakstegemiseks kasutatakse reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga sellele iseloomulik pruun värvus ei kao, küllastumata rasvhapete puhul muutub lahus värvusetuks.
CH 3(CH 2)nCH=CH(CH 2)mCOOH + Br2 CH 3(CH 2)nCHBr-CHBr(CH 2)mCOOH
Töö käik Kolme kuiva katseklaasi valati 2 ml erineva lipiidi lahust: rasvhape ( stearhape ), taimne rasv (oliiviõli), ja loomne rasv (searasv). Lisati tilkhaaval võrdne kogus broomi lahust kloroformis, loksutati.
Tulemus Stearhapet sisaldavas katseklaasis jäi püsima broomile iseloomulik pruunikas värvus, seega stearhape on küllastunud rasvhape. Oliiviõli ja searasva puhul muutus lahus värvusetuks ­ sisaldavad küllastumata rasvhappeid.
1.3.5 Liebermann -Burchard'i kolesterooli määramise test Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud arvukalt (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõppkokkuvõttes tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. Samas aga positsioonis C17 paiknev süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.
Kolesterool
Töö käik Kolme kuiva katseklaasi valati 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis: kolesteroolilahus, taimne rasv (rapsiõli), loomne rasv (searasv). Katseklaasidesse lisati 6-7 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilka kontsentreeritud väävelhapet, loksutati.
Tulemus Katse ei andnud oodatud tulemusi. Kolesteroolilahus oleks pidanud värvuma rohekas -siniseks. Esimesel korral andis õrnalt punaka lahuse, katse kordamisel värvuse muutust ei toimunud üldse. Taimset rasva sisaldavas katseklaasis tekkis õrn hägu, kuigi tegelikult oleks pidanud värvuma nõrgalt
5 sinakaks taimsete steroolide sisalduse tõttu. Searasva sisaldavas katseklaasis muutusi ei toimunud ­ ei sisalda kolesterooli. Ilmselt oli katse ebaõnnestumise põhjus äädikhappe või väävelhappe lahuses.
6