Biokeemia lipiidid ja karotenoidid (2)

TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia
Laboratoorne töö nr: 2
Töö pealkiri:
Lipiidide reakstioonid ja karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Õpperühm:
Töö teostaja :
Õppejõud:
Terje Robal
Töö teostatud:
21.02.2012
Protokoll esitatud:
05.03.2012
Protokoll arvestatud:
1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulides esinevad enamasti estersidemed. Tavaliselt ei lahustu lipiidid vees ja vesilahustes, vaid apolaarsetes orgaanilites solventides. Vähemal määral lahustuvad nad polaarsetes solventides. Lipiidid on rakumembraanide põhiliseks komponendiks. Nii loomsetes organismides kui ka mitmetes taimsetes kudedes on nad peamiseks energeetiliseks varuaineks. Peale selle on neil veel kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid. Nad on signaalmolekulideks ning mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus. Üldiselt rühmitatakse lipiide rasvhapeteks, rasvadeks, glütserofosfolipiidideks, sfingolipiideks, vahadeks, steroidideks ja terpenoidideks. Lähtudes seebistumisvõimest võib lipiide jaotada seebistuvateks ja mitteseebistuvateks. Vastavalt molekuli struktuurile võib lipiidid jaotada ka veel liht-, liit- ning tsüklilisteks lipiidideks . Rasvamolekulid on sobivad toiduenergia säilitamiseks. Inimesele on erilise tähtsusega linool - ja α-linoleenhape ehk asendamatud rasvhapped , mida inimorganism ise ei sünteesi. Olulisemaiks loomseks sterooliks on kolesterool , mida leidub pea kõikide loomsete rakumembraanide koostises ja mis tagab membraanide läbitavuse ja liikuvuse/voolavuse. Lisaks sellele toodetakse kolesteroolist sapphappeid, steroidhormoone ning D-vitamiini, kuid kõrget kolesteroolitaset peetakse südame- ja veresoonkonna haiguste riskifaktoriks .
1.3.1 Rasvapleki proov
Lipiidid lahustuvad orgaanilistes lahustites . Kui lipiidi sisaldavat lahust kanda paberile, tekib rasvaplekk ja paberi läbipaistvus suureneb. Vastu valgust vaadates on rasvaplekk heledam, pimeda poole vaadates tumedam . Järeldusi saab teha kauiva prooviga.
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi pannakse kaht tahket materjali, milles tahetakse lipidi olemasolu kindlaks teha. Mõlemasse lisatakse kuni 0,5 ml orgaanilist lahustit. Loksutatakse ja lastakse umbes 5 minutit seista. Filterpaberile pipeteeritakse mõlemat lahust ja lastakse kuivada. Kuiva paberit vaadata valguse ja varju suunas.
Järeldused
Lipiide sisaldas proov number 2. Pärast filterpaberi kuivamist, mille käigus orgaaniline lahusti aurus, jäi paberile rasvaplekk, mis vastu valgust vaadates paberi läbipaistvust suurendas.
1.3.2. Emulsioonitest
Emulsiooni moodustumisest annab märku selge lahuse muutumine häguseks, sest emulsioonid hajutavad läbivat valgust. Kui orgaanilises solvendis lahustatud rasv viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt loksutada , tekib õli-vees tüüpi emulsioon .
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi valatakse 2 ml 96%-list etanooli ja lisatakse 2 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks sisaldab lipiidi, teine mitte. Katseklaase loksutatakse. Seejärel lisatakse mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutatakse veel. Lipiidi sisaldavas katseklaasis muutub segu häguseks.
Järeldused
Hägusus tekkis esimest proovi sisaldavas katseklaasis. Tekkis õli-vees tüüpi emulsioon.
1.3.3 Akroleiiniproov
Glütserooli kuumutamisel tekib terava lõhnaga propenaal ( akroleiin ). Sama juhtub ka rasvade ja glütserofosfolipiidedega, kuid mitte lipiididega, mis ei sisalda glütserooli.
CH2OH -CHOH-CH2OH → CH2=CH-CHO + H2O
Glütserool (propaantriool) Akroleiin (propenaal)
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi pannakse ~1g KHSO4 või NaHSO4 ja lisatakse mõni tilk akroleiintesti proovidest 1 ja 2. Katseklaase kuumutatakse tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulab ja proov tumeneb, mis annab märku akroleiini moodustumisest. Käega õhku enda suunas tõmmates, tehakse nuusutamise teel kindlaks, kumb proov sisaldas lipiidi.
Järeldused
Glütserooli sisaldav lipiid oli esimeses uuritavas proovis. Kuumutamisel tekkis terav lõhn, mis meenutas rasva kärsahaisu. Haisu tekitas glütserooli kuumutamisel tekkiv propenaal.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemist lipiidides uuritakse halogeenidega reaktsiooni abil. Küllastunud rasvhappeid sisaldav proov moodustab broomiga pruuni värvuse, küllastumata rasvhapete korral muutub lahus momentaalselt värvituks.
CH3(CH2)CH=CH(CH2)mCOOH + Br2 → CH3(CH2)nCHBr-CHBr(CH2)mCOOH
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis: rasvhappe (stearhappe või palmithappe), taimse rasva ja loomse rasva lahust. Igasse katseklaasi lisatakse tilkhaaval võrdne kogus (kuni 10 tilka) broomi lahust kloroformis e triklorometaanis, loksutatakse. Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks broomi lahus säilitama iseloomuliku kollakas -pruuni värvuse, teistes kahes aga toimub värvuse muutus.
Järeldused
Kasutasin palmithapet, oliivõli ja searasva. Palmithappe ja broomi lahus muutus oranžiks, teised praktiliselt värvituks, kuid searasva lahus oli pisut tumedam kui oliivõli oma. Võib järeldada, et esimeses lahuses (palmithape ja broom ) oli rasvhape küllastunud. Teistes lahustes olid küllastumata rasvhapped, kuid oliivõli ehk taimse rasva lahus oli kõige vähem küllastunud.
1.3.5 Liebermann-Burchard'i kolesterooli määramise test
Kui kolesterooli reageerib äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas muutub lahus tume sinakas -roheliseks. Reaktsioon on mitmeastmeline ja tekivad ka punane ja sinine vaheühend. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud palju reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone nagu näiteks steraanituuma oksüdeerumine ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõpuks tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. C17 asendis paiknev süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis (kolesteroolilahus, taimse ja loomse rasva lahust). Igasse katseklaasi lisatakse 6-7 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilka konts. väävelhapet. Loksutatakse hoolikalt.
Järeldused
Esimeses katseklaasis kolesteroolilahus, teises rapsiõli ja kolmandas searasv. Esimene lahus värvus äädikhappe anhüdriidi ja väävelhappe lisamisel tumesinakasroheliseks, mida võiski oletada. Teistes katseklaasides olid lahused kollakaspunakad. Taimerasvas ei sisaldunud kolesterooli, küll aga mingil määral searasvalahuses.
KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
Teooria
Karotenoidid on taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides ning ka mõningates teistes organismides sisalduvad fotosünteesi abipigmendid. Nad absorbeerivad valgust klorofüllist pisut erineval lainepikkusel ja on niimoodi täiendavateks kiirguse retseptoriteks. Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen.
Karotenoidide kaks põhigruppi on:
•karoteenid – hapnikku mittesisaldavad molekulid, koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust; Nt: karoteeni α -, β -, γ-, δ-, ζ- jt isomeerid , samuti lükopeen,
•ksantofüllid – hapnikku sisaldavad molekulid; Nt: luteiin , zeaksantiin jt.
Karotenoidid ka kaitsevad taimi liigse valguseenergia, taimerakke fotokahjustuse ja vabade hapnikuradikaalide eest. Loomsetes organismides leidub neli karotenoidi: α-, β- ja γ- karoteen ning β-krüptoksantiin. Vitamiin A loob fotokeemilise aluse nägemisprotsessile. Lisaks sellele on ta ka antioksüdant ning kaitseb silmi sinise ja UV kiirguse eest. Eukarüootides omavad karotenoidid olulist rolli rakkudevahelises suhtluses , stimuleerides valk konnektsiini ekspressiooni. Loomsed organismid omastavad karotenoide loomse toiduga. β-karoteen esineb punakas-oranžide kristallidena ja ei lahustu vees ja vesilahustes. Ka polaarsetes lahustites on karoteeni lahustuvus piiratud, kuid selle eest lahustab karoteen hästi apolaarsetes lahustites Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma. Kõik karotenoidid on värvilised, kusjuures värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Karotenoididel on võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas (~400...~700 nm). Uuritava materjali karotenoidset koostist saab iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi. Viimane kujutab endast absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D, OD) sõltuvust uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest λ. Puhtal β-karoteenil on apolaarsetes lahustites omased neeldumismaksimumid (λmax) spektri sinises piirkonnas 425, 450 ja 480 nm juures. Kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võivad neeldumismaksimumid paikneda nimetatuist erinevatel lainepikkustel. Kui proovis sisaldub samal ajal ka klorofüll, siis on neeldumismaksimumid lainepikkuste ~470 ja ~630 nm juures.
Töö eesmärk: on karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest, saadud karotenoidide (ja klorofülli) segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel:
􀂾 uuritava materjali karotenoidse koostise analüüsimine ja iseloomustamine ,
􀂾uuritavas objektis domineeriva karotenoidi, β-karoteeni või mõne teise, kontsentratsiooni kindlaksmääramine,
􀂾 klorofülli olemasolu kindlakstegemine.
Töö käik
Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist
Eelpeenestatud taimsest materjalist (näiteks nagu toored juur - ja köögiviljad, tsitrusviljad , männiokkad vm) kaalutakse tehnilistel kaaludel proov 0,5–2,0 g. Proovi suurus oleneb eelkõige objekti niiskusesisaldusest ja karotenoidide sisaldusest selles. Proov viiakse ilma kadudeta uhmrisse, lisatakse väike kogus pestud liiva ja hõõrutakse nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni. Edasi lisatakse vee sidumiseks veevaba Na2SO4 jätkates samal ajal massi hõõrumist. Na2SO4 lõplik kogus sõltub proovi veesisaldusest ja võib ületada proovi kaalutist 5–10-korda. Soola lisamine lõpetatakse kui on tekkinud ühtlane pulbriline mass. Pärast seda lahustatakse karotenoidid orgaanilise lahustiga ja filtritakse tekkinud lahus läbi paberfiltri mõõtsilindrisse. Uhmris olevale peenestatud massile lisatakse väikeste koguste kaupa ekstrahenti. Esimene lahusti portsjon peaks olema suurem, tesied väiksemad. Segu segatakse uhmri nuiaga ja lastakse sademel settida. Vedelik viiakse lusikaga mõõtsilindrisse, mida vähem sadet seda parem. Seda tegevust korratakse kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. Kõik ekstraktid viiakse ühte kogumisnõusse. Lõpuks määratakse kindlaks ekstrakti kogumaht . Töö toimub tõmbe all!
Kasutasin pulbrilist paprikat (maitseaine). Ekstrahendiks oli oktaan .
Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs
Enne tööle asumist tuleb tutvuta spektromeetri kasutusjuhistega. Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350–650 nm. Spektromeeter nullitakse kasutatud ekstrahendiga. Töötada võib klaasküvettidega, sest mõõtmine toimub nähtava valguse lainepikkusel. Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter. Sealt loetakse lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid (λmax) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Järgneb spektri analüüs. Spektri analüüsimisel võrreldakse uuritava lahuse neeldumisspektril esinevate neeldumismaksimumide asukohti (lainepikkusi) teatmeteostes leiduvate andmetega, järeldatakse kas tegemist on puhta β-karoteeniga või karotenoidide seguga .
Karotenoidi sisalduse arvutamine ( kvantitatiivne analüüs)
Kasutatakse neeldumisspektri analüüsimisel saadud andmeid – neeldumis -maksimumidele λmax vastavaid absorptsiooni (A) väärtusi. Reeglina võetakse arvutamisel aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektril kõige kõrgemale „tipule“. Arvutus põhineb nimetatud lainepikkusele (λmax) vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. Valemi jaoks tuleb teatmekirjandusest leida uuritavas lahuses domineeriva karotenoidi Ε1% 1cm väärtus. Karotenoidi sisaldus (K, mg %) uuritavas proovis arvutatakse valemiga:
A * V * d * 103
K=------------------------------ mg%
E1%1cm * g
A – absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile λmax (kõrgeimale „tipule“ vastav A väärtus),
Ε1cm1% – vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon ) sama λmax juures,
V – ekstrakti kogumaht, ml,
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3,
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g,
103 – tegur milligrammidele üleminekuks.
(Ma ausõna tegin kõik asjad nii nagu teised ja ma ei tea, mis mul viltu läks.) Paprikat kaalusin 22.9 mg. Lisasin väikse koguse liiva ja peenestasin uhmris. Panin juurde naatriumsulfaati kuni tekkis pulbritaoline mass. Kuid millegi tõttu oli minu ekstrakt kohe värvusetu, mitte kollakas nagu teistel.
Tulemused kursuseõelt:
Spektrite lainepikkused ja optilised tihedused:
502nm – 0, 3138 A
480nm- 0,370 A
Kirjanduse alusel leidsin, et need lainepikkused sarnanevad kõige rohkem karoteen lükopeeniga:
E= 2250 1%/1cm.
D= 0,704 g/cm3
V= 6 ml
G= 21,4 x 10^-3
K= (0,3138 x 6 x 0.704 x 10^3) / ( 2250 x 0,0214) = 27,5 mg%
Leidke ikka lükopeeni sisaldus, sest selle karotenoidi ekstraheerisite te oma uuritavast proovist. Neid lükopeeni lehekülgi on internetis sadu.
Prooviks oli paprikapulber. Lükopeeni peaks kirjanduse järgi olema ‎308,1 μg/g. = 30,81 mg%, mis on üsna sarnane minu arvutustulemusega.
http://www.dietaryfiberfood.com/antioxidants/lycopene-food-sources.php