Karotenoidid (0)

Ilona Juhanson , 123964YASB
Laboratoorne töö nr: 4
Töö pealkiri:
Lipiidide reaktsioonid, karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Õpperühm:
YASB21 C
Üliõpilane:
Ilona Juhanson, 123964YASB
Juhendaja :
Tiina Randla
KAROTENOIDID
Laboratoorse töö eesmärgiks on karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest , saadud karotenoidide (ja klorofülli) segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel:
* uuritava materjali karotenoidse koostise analüüsimine ja iseloomustamine ,
* uuritavas objektis domineeriva karotenoidi kontsentratsiooni kindlaksmääramine,
* klorofülli olemasolu kindlakstegemine .
Karotenoidid on abipigmendid fotosünteesivates organismides, kuna absorbeerivad valgust klorofüllist erinevatel lainepikkustel, mistõttu on täiendavateks kiirguse retseptoriteks. Karotenoidid on 600+ ühendist koosnev rühm.
Keemilise ehituse poolest klassifitseeritakse kui tetraterpenoide (sisaldavad 40 süsiniku aatomit). Kujutavad endast polüeenseid aheldaid, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid. Pikima ahelaga on lükopeen, mis on tähtsaks vaheühendiks paljude karotenidide sünteesis.
Kaheks karotenoidide põhigrupiks on karoteenid (Sisaldavad vaid C ja H, hapnikku mitte. Nt karoteeni α-, β -, γ -, δ -, ζ - isomeerid, samuti lükopeen) ja ksantofüllid (sisaldavad hapnikku, nt luteiin , zeaksantiin jt).
Karotenoidid täidavad lisaks valguse absorbeerimisele ja klorofüllile edastamisele ka kaitsvat rolli, mis kujutab endast liigse valgusenergia neelamist ning rakkude fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest kaitsemist.
Loomsetele organismidele on neli karotenoidi vitamiin A eelühenditeks ehk provitamiinideks (α -, β -, γ - karoteen ja β -krüptoksantiin). β-karoteenist tekib kaks, α- ja γ-karoteenist ning β -krüptoksantiinist üks retinaali molekul . Karotenoidide konverteerumine retinaaliks toimub sooles mikrofloora poolt toodetava karoteeni oksügenaasi toimel. Lisaks retinaalile omavad vitamiin-A aktiivsust ka retinool, retineenhape ja retinooli estrid .
Vitamiin A (retinaal) esmaseks funktsiooniks on nägemisprotsessi tagamine, luues selles fotokeemilise aluse. Ta toimib ühtlasi antioksüdandina, tõkestades loomorganismides lipiidide oksüdatsiooni ning kaitstes silmi kahjuliku sinise ja UV-kiirguse eest. Retinooli metabolismi käigus tekkiv retineenhape toimib transkriptsiooni regulaatorina, mõjutades kasvu ja rakkude diferentseerumist. Lükopeen ja β -karoteen mängivad tähtsat rolli rakkudevahelises suhtluses valk konnektsiini ekspressiooni stimuleerimise tõttu (valk konnektsiin moodustab rakumembraanides aukliideseid, mille kaudu toimub madalmolekulaarsete ühendite ja ioonide rakkudevaheline liikumine).
Puuduse korral tekivad nägemishäired, mis pikema aja vältel võivad lõppeda nägemisvõime kaotusega. Esineb immuunsüsteemihäireid nt kõrva- ja kuseteedenakkuste suhtes, hüperkeratoos. Lapseootel või rinnaga toitvate naiste puhul on A vitamiin oluline loote normaalseks arenguks ning antud vitamiini puudust sünnijärgselt korvata ei saa. Samuti võib selle vitamiiniga liialdamine põhjustada sünnidefekte. (Wikipediast)
Karotenoide loomsed organismid ise ei sünteesi, mistõttu tuleb neid omastada taimse toiduga. Nende imendumiseks peavad nad vabanema taimerakkudest ja konjugeeruma sapphapetega.
β-karoteen
Looduslikest objektidest isoleerituna esineb punakas-oranžide kristallidena.
Kristallid sulavad 183-184⁰C juures.
Ei lahustu vees, vesilahustes ega etanoolis .
Alifaatsetest ja tsüklilistest süsivesikutest apolaarsetes orgaanilistes lahustites aga lahustub (petrooleeter, bensiin , dietüüleeter).
Pole optiliselt aktiivne.
On värvilised; kollasest tumepunaseni.
Mida rohkem neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel, seda intensiivsem on punane värvus.
Neelavad valgust lainepikkustel λ=400 kuni 700 nm. See tuleneb karotenoidide ehitusest, mida iseloomustab polüeensus (pikk konjugeeritud kaksiksidemetega süsivesinikahel).
Karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri (A või D sõltuvus uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest λ) järgi. Puhtal β - karoteenil on nt heksaanis/petrooleetris jt iseloomulikud neeldumismaksimumid (λmax) spektri sinises piirkonnas 425, 450 ja 480 nm juures.
Erinevate karotenoidide sisaldumise korral võib neeldumisspekter oluliselt muutuda ja neeldumismaksimumid võivad paikneda nimetatuist erinevatel lainepikkustel. Kui proovis on ka klorofülli, on täheldatavad neeldumismaksimumid u 470 ja 630 nm juures.
Töö käik
Kaalusin kaaluklaasi 0,52 g riivitud porgandit . Seejärel panin kaalutud porgandi uhmrisse ning uhmerdasin koos liivaga (abrsasiiv) ja soolaga (vee sidumiseks) ühtlaseks pulbriks. Seejärel ekstraheerisin karotenoide heptaaniga (ρ=0,72 g/cm3), kuna selles karotenoidid lahustuvad, kuid sool ega liiv mitte. Olin ennem valmis pannud mõttesilindri koos lehtri ja filterpaberiga selleks, et ekstraheerimisel saadud karotenoidide lahust filtrida. Ekstraheerisin, kuni lahus muutus peaaegu värvusetuks. Kogumahuks sain 23,5 ml.
Uhmri ja muud heptaaniga kokkupuutunud töövahendid jätsin tõmbe alla, et heptaan saaks aurustuda.
Neeldumisspekter mõõdetakse vahemikus 350 - 650 nm ning võrdluslahuseks on puhas lahusti (heptaan).
Neeldumismaksimumid:
Tipp
Absorptsioon
1.
478,0 nm
0,2985 A
2.
452,0 nm
0,3352 A
3.
422,5 nm
0,2281 A
β – karoteenile kõige sobivam (420, 445, 475)
Karotenoidi sisalduse määramine:
Uuritavas proovis kasutatakse neeldumismaksimumidele λmax vastavaid absorptsiooni väärtusi. Reeglina kasutatakse sellist A väärtust, mis vastab kõrgeimale tipule. Arvutus põhineb nimetatud lainepikkusele vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinkstsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele.
K = = 3,665 mg %
Porgandis on valdavalt 88% vett, 7% suhkrut, 1% valku, 1% kiudaineid, 1% tuhka ja 0,2% rasva. Kiudainest moodustab enamuse tselluloos . Porgand sisaldab suhkrutest sukroosi, glükoosi, ksüloosi ja fruktoosi. Porgandile iseloomulik maitse tuleneb glutamiinhappest ning teistest vabadest aminohapetest. 100 g porgandi kohta on ligikaudu 6000 kuni 54000 mikrogrammi karotenoide.
(Wikipedia).
Kaalutis – 0,52 g
Sisaldus – 3,665 mg %
100 g porgandi kohta peaks olema 5,4-6 mg %. Järeldan sellest, et prooviks oleva porgandi karotenoidide sisaldus on väiksem tavapärasest.
LIPIIDIDE REAKTSIOONID
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersidemete esinemine. Reeglina pole vees ega vesilahustes lahustuvad, vaid apolaarsetes orgaanilistes solventides nagu näiteks kloroform (CHCl3). Lahustumatus on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis.
Lipiidid on kõikides organismides rakumembraanide põhiliseks koostiskomponendiks ning kudedes peamiseks energeetiliseks varuaineks. Sellele lisaks täidavad nad ka kaitse- ja regulatoorseid funktsioone, on signaalmolekulideks ning olulisteks osatäitjateks hormonaalses tasakaalus.
Lipiidide levinuim rühmitamine on järgmine: rasvhapped , rasvad , glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid , vahad, steroidid , terpenoidid .
Samuti saab neid liigitada seebistuvateks (rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad) ja mitteseebistuvateks ( steroolid , prostaglandiinid, terpenoidid).
Lihtlipiidid - rasvad, vahad
Liitlipiidid - fosfo - ja glükolipiidid
Tsüklilised lipiidid - tsükliliste alkoholide baasil moodustuvad lipiidid ehk kolesteriidid.
Rasvad e triatsüülglütseroolid/triglütseriidid on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid.
Sobivad hüdrofoobsuse tõttu toiduenergia säilitamiseks ning on loomades akumuleerunud rasvadepoodesse, kõrgemates taimedes seemnetesse. Naturaalsetes rasvades sisaldub lai valik erinevaid rasvhappeid , nii küllastunud kui küllastamata, millest inimesele on erilise tähtsusega linool - ja α- linoleenhape . Neid inimorganismis ei sünteesita, mistõttu peab neid saama toidust.
Looduslikel küllastumata rasvhapetel on kaksiksidemed valdavalt cis-konfiguratsioonid, mistõttu on ahel kujult väändunud. Kuna trans-konfiguratsioonis küllastumata rasvhapete ahelad on sik-sak-kujuga, käituvad need biomembraanides sarnaselt küllastunud rasvhapetele ning on raskesti metaboliseeritavad.
Glütserofosfolipiidid on kõikide rakumembraanide peamiseks koostisosaks ning kujutavad endast amfifiilseid molekule, kus on kaks rasvhappe radikaali (hüdrofoobne osa) ja fosforhappejääki (sellele seonduvad aminoalkoholid ja moodustub polaarne tsenter ). Oma amfifiilsuse tõttu saavad nad moodustada vesikeskkonnas struktuure nagu membraanid , vesiikulid või liposoomid.
Steroolide e steroidalkoholide ehituslikuks aluseks on steraanituum, st tsüklopentanoperhüdrofenantreen (3 tsükloheksaani ja 1 tsüklopentaani tsükkel), mis C-3 asendis on hüdroksüleeritud. Seeläbi saavad rasvhapped estreid moodustada, andes steriide.
Levinuim loomne sterool on kolesterool , mida leidub pea kõikide loomsete rakumembraanide koostises ja mis tagab membraanide läbitavuse ja liikuvuse. Kolesteroolist saab toota ka sapphappeid, steroidhormoone ja D-vitamiini.
Taimerakkude membraanides täidavad sarnast funktsiooni fütosteroolide esindajad ergosterool, stigmasterool, kampesterool jt, mis erinevad kolesteroolist ja üksteisest C-17 asendusrühma ehituse poolest. Mitmetes taimeõlides (nt maisi- ja sojaõli jt) on fütosteroolide sisaldus märkimisväärselt kõrge ning küündib sadade milligrammideni 100 g õli kohta. Fütosteroolidele omistatavat positiivset toimet inimorganismile põhjendatakse asjaoluga, et nad taistavad kolesterooli imendumist.
Rasvapleki proov
Kõikide lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb.
Töö eesmärgiks on tuvastada, kumb kahest proovist lipiide sisaldab, kasutades selleks rasvapleki proovi.
Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam . Oluline on vaadata läbi kuivanud paberi, kuna niiske paberi läbipaistvus on suurenenud ka lipiide mittesisaldava lahuse korral.
Töö käik
Antud on kaks materjali, millest üks sisaldab lipiide. Võtta kaks kuiva katseklaasi, millesse pannakse umbes 1 g uuritavat ainet. Mõlemasse katseklaasi lisatakse mitte rohkem kui 0,5 ml orgaanilist lahustit , milleks kasutasin atsetooni . Loksutasin hoolikalt ja lasin tahke materjali settimiseks viis minutit seista. Kui sademe kohale oli tekkinud selge lahuse kiht, kandsin mõlemast katseklaasist pipetiga mõned tilgad lahust filterpaberile ning lasin kuivada. Seejärel vaatasin pabereid vastu valgust.
Esimese proovi korral paistis paber läbi, kuid teisest proovist saadud lahusel paberi läbipaistvusele mõju ei olnud. Järeldan sellest, et esimene proov sisaldas lipiide.
Emulsioonitest
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust (dispergeerunud faas), millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teise vedelikus (pidevas faasis). Kuna emulsioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.
Rasvade kui rasvhapete glütserüülestrite iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus st lahustumatus vees ja vesilahustites. See-eest lahustuvad nad orgaanilistes solventides nagu kloroform, benseen , atsetoon, metanool jt. Kui taolises solvendis valmistatud rasvlahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt segada/ loksutada , moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .
Emulsioonid on toiduainete valdkonnas levinud (nt piim, õli-vees, või, vesi-õlis), värvitööstuses lateksvärvidena jne. Tihti sisaldavad emulsioonid stabiliseerivaid lisandeid.
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi valatakse 2 ml 96%-list etanooli ja lisatakse 2 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks sisaldab lipiidi, teine mitte. Katseklaase loksutada homogeense lahuse moodustumiseni. Seejärel lisada mõlemasse 4 ml dest.vett ja loksutada intensiivselt.
Teises katseklaasis tekkis valge sade, mis tõestab glütseerüülestrite olemasolu, esimeses aga muutusi ei toimunud, mis tõestab nende puudumist.
Järeldan sellest, et II proov sisaldas lipiide, ning I proov mitte.
Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll veidi lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis : rasvhappe (steaarhappe või palmithappe), taimse rasva ja loomse rasva lahust. Kõigisse katseklaasidesse lisatakse tilkhaaval võrdne kogus (kuni 10 tilka) broomi lahust kloroformis e triklorometaanis, loksutatakse ning jälgitakse toimuvaid muudatusi. Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks broomi lahus säilitama iseloomuliku kollakas -pruuni värvuse, teistes kahes aga toimub värvuse muutus.
Rasvahappelahuseks oli palmithappelahus, taimse rasva lahuses oli rapsiõli ning loomse rasva lahuseks või.
Palmithappega lahus säilitas broomi värvi, mis küll natuke tumenes, kuna võisin broomi liialt palju kogemata lisada. See tõestab küllastunud rasvhapete sisaldumise palmithappelahuses. Rapsiõliga lahuses jäi lahus valdavalt läbipaistvaks kerge punaka tooniga, kuna võisin broomi lahust kogemata liiga palju lisada. Rapsiõlis sisalduvad pigem küllastumata rasvhapped. Või lahus värvus katse käigus punakaks, mis samuti tõestab küllastunud rasvhapete olemasolu lahuses.
Praktika kinnitab teooriat, kuid broomi ei tohi rohkem lisada, kui on ette nähtud. Vastasel juhul võib valesid järeldusi teha.
Liebermann -Burchard'i kolesterooli test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üles punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Tekibki kokkuvõttes kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu, kusjuures C-17 asendi süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valada 2 ml erineva lipiidi lahust (kolesteroolilahus, rapsiõlilahus, võilahus) metüleenkloriidis. Igasse katseklaasi lisada 6-7 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilkga kontsentreeritud väävelhapet. Loksutada hoolikalt.
Kolesteroolilahusega katseklaasis värvus lahus tumeroheliseks, taimse rasva lahuses hästi õrnalt roheliseks ning loomse rasva lahuses veel õrnemalt roheliseks.
Rapsiõliga katseklaasis toimunud värvimuutus jätab mulje nagu rapsiõlis oleks kolestorool, kuid tegelikult sisaldab see fütosterooli, mis sarnaneb kolestoroolile, mistõttu on värvus heledam kui võilahuse puhul, mis sisaldab kolesterooli.
Roheline värvimuutus tuleb kolesterooli leidumisest lahuses, kus kolesterooli -OH rühm reageerib alglahusesse lisatud reagentidega. Mida tugevam värvus, seda suurem sisaldus.