Lipiidide praktikum (lipiidide reaktsioonid ja karotenoidide määramine) (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Õppeaine YKL0063
Biokeemia
PRAKTIKUM :
Lipiidide reaktsioonid
&
Karotenoidide idenfitseerimine ja sisalduse määramine
Üliõpilane: Juhendaja : 
Kood:
Esitatud:
Sooritatud :
1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
Teooria
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersideme(te) esinemine.
Lipiidid ei lahustu vees ja vesilahustes, vaid apolaarsetes orgaanilistes solventides, vähemal määral lahustuvad nad polaarsetes solventides. Lipiidide lahustumatus vees ja vesilahustes on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis.
Lipiide võib vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele klassifitseerida mitmeti.
Üldlevinud on järgmine rühmitamine:

• rasvhapped ,
  
• rasvad ,
  
• glütserofosfolipiidid,
  
• sfingolipiidid,
  
• vahad,
  
• steroidid,
  
• terpenoidid .
  

Lähtudes seebistumisvõimest võib lipiide jaotada:

• seebistuvateks (rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad),
  
• mitteseebistuvateks ( steroolid , prostaglandiinid ja terpenoidid).
  

Vastavalt molekuli struktuurile:

• Lihtlipiidid ((neutraal)rasvad ja vahad)
  
• Liitlipiidid (fosfo- ja glükolipiidid)
  
• tsüklilised lipiidid (tsükliliste alkoholide baasil moodustuvaid lipiide).
  

Rasvad e. triatsüülglütseroolid on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Hüdrofoobsed rasvamolekulid sobivad toiduenergia säilitamiseks.
Naturaalsetes rasvades sisaldub lai valik erinevaid, nii küllastunud kui küllastumata rasvhappeid . Inimesele on erilise tähtsusega linool- ja α- linoleenhape (nn asendamatud rasvhapped), neid inimene saab toidurasvadega.
Looduslikel küllastumata rasvhapetel esinevad kaksiksidemed valdavalt cis-konfiguratsioonis (ahel on kujult väändunud). Trans - konfiguratsioonis küllastumata rasvhapete ahelad on sik-sak-kujuga ning seega käituvad biomembraanides sarnaselt küllastunud rasvhapetele.
Kõikide rakumembraanide peamiseks koostisosaks olevad glütserofosfolipiidid kujutavad endast amfifiilseid (= amfipaatseid) molekule. Just amfipaatsuse tõttu saavad need lipiidid moodustada vesikeskkonnas struktuure, nagu membraanid, vesiikulid või liposoomid.
Steroolide ehk steroidalkoholide ehituslikuks aluseks on steraanituum, st tsüklopentano- perhüdrofenantreen (seostunud 3 tsükloheksaani ja 1 tsüklopentaani tsükkel), mis asendis C-3 on hüdroksüleeritud. Steriidid - steroolide rasvhapetega estreid. Levinuim loomne sterool on kolesterool .
Mitmetes taimeõlides (maisiõli, sojaõli jt) on fütosteroolide sisaldus märkimisväärselt kõrge, küündides sadade milligrammideni 100 g õli kohta. Fütosteroolidele omistatavat positiivset toimet inimorganismile põhjendatakse asjaoluga, et nad takistavad kolesterooli imendumist.
1.3.1 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll veidi lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis: 1. palmiithappe 2. rapsiõli 3. searasv . Kõigisse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval 7 tilka broomi lahust kloroformis e triklorometaanis ja loksutasin
Tulemus ja järeldus
Katseklaas palmiithappega säilitas kollakas -pruuni värvuse, teised on värvuseta. Võib järeldada, et ainult palmiithappe sisaldab küllastunud rasvhappeid, rapsiõli ning searasv sisaldavad küllastumata rasvhappeid.
1.3.2 Liebermann-Burchard'i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud arvukalt (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust kloroformis: 1. kolesteroolilahus, 2. päevalillaõli, 3. searasv. Igasse katseklaasi lisasin 6 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning loksutasin hoolikalt.
Tulemus ja järeldus
Kolesterooli roheline värv näitab, et teistes katseklaasis väiksem kolesterooli sisaldus. Kõige vähem kolesterooli sisaldus 3. katseklaasis, kus on searasv (värvitu). 2. katseklaasis (päevalillõliga) , kus tekkis sinine ja punane värv on rohkem kolesterooli kui kolmandas katseklaasis.
2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
Teooria
Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides (ka teistes fotosünteesivates organismides) sisalduvad fotosünteesi abipegmentidena karotenoidid .
Karotenoidid absorbeerivad valgust florofüülist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ja on seega täiendavateks kiirguse retseptoriks.
Karotenoidid on väga arvukas (> 600) ühendite rühm. Neid klassifitseeritakse kui tetraterpenoidid (sisaldavad 40 süsiniku aatomit). Struktuurilt on nad polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid.
Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen ( tähtis vaheühend paljude teiste karotenoidide sünteesis.
Karotenoidid täidavad ka kaitsvat rolli (neelavad liigset valgusenergiat ja kaitsvad rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
Loomsetel organismidel: α – karoteen ; β – karoteen; γ – karoteen; β - krüptoksantiin ( vitamiin A eelühenditeks (= provitamiinideks));
Vitamiin A-aktiivsust omavad ka retinool, retineenhape ja retinooli estrid . Vitamiini A funktsioonid:

nägemisprotsessi tagamine (loob fotoskeemiline alus)

antioksüdant (tõkestab loomorganismides liipidide oksüdatsioon, kaitseb silmi kahjuliku sinise UV-kiirguse eest)

transkriptsiooni regulaatorina (mõjutab kasvu ja rakkude diferentseerumist)

rakkudevaheline suhtlemine (stimuleerivad valk konnektsiini ekspressiooni)

diferentseerumise ja kudude homöstaasi tagamine
Loomsed organismid saavad karotenoide taimse toiduga. Karotenoidide imendumiseks peavad nad vabanema taimerakkudest ning konjugeeruma sapphapetega.
Karoteeni isomeeridest omab suurimat tähtsust β - karoteen. Optilist aktiivsust β - karoteen ei oma. Kõik karotenoidid on värvilised, kusjuures värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas
Käesoleva laboratoorse töö eesmärgiks on karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest , saadud karotenoidide (ja klorofülli) segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel:

• uuritava materjali karotenoidse koostise analüüsimine ja iseloomustamine ;
  
• uuritavas objektis domineeriva karotenoidi, β-karoteeni või mõne teise, kontsentratsiooni kindlaksmääramine;
  
• klorofülli olemasolu kindlakstegemine.
  

Töö kaik
Eelpeenestatud taimsest materjalist ( paprika ) kaalusin tehnilistel kaaludel proov 0.62 g. Eelpeenestasin proovi väikesteks tükkideks noaga. 50 ml tuubi lisasin tõmbkapi all mõõtsilindriga mõõdetud 15 ml apolaarset solvent - petrooleeter . Järgnevalt peenestatakse materjal homogenisaatoriga 2 minuti jooksul tõstes esimese minuti jooksul sujuvalt pöördeid.
Kui mass oli peenestatud, lisasin segule vee sidumiseks umbes pool teelusikat Na2SO4. Loksutasin ja panin seista 5 minutit.
Järgnevalt viiakse läbi ekstrakti filtrimine ning selleks võtsin 25 ml kuiv mõõtsilinder, kuhu peale paigutasin klaaslehter ning kuiv paberfilter. Eelnevalt saadud segu filtreeritakse seejärel lisatakse tuubi veel 5 ml petrooleetrit, segatakse vortexil ning filtreeritakse. Viimane samm korratakse. Mõõtsin saadud lahuse maht ja sain V = 15,5 ml.
Mõõdetakse lahuse neeldumisspekter spektrofotomeetriga lainepikkuste vahemikus 350-650 nm.
Tulemus
Neeldumismaksimumid λmax (nm)
Absorptsiooni väärtus (A)
450,0
0,4911
472,5
0,5487
504,0
0,2241
Käsiraamatust:

• Lükopeen (446; 472; 506) nm → E%1cm = 3450
  
• Kapsantiin (504; 475; 462) nm → E%1cm = 1905
  

Karotenoidi sisalduse arvutamine ( kvantitatiivne analüüs)
Karotenoidi sisaldus (K, mg %) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt siintoodud valemile:
kus
A - absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile λmax (kõrgeimale „tipule" vastav A väärtus),
E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse
absorptsioon ) sama λmax juures,
V - ekstrakti kogumaht , ml,
d - kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3,
g - uurimiseks võetud taimse materjali mass, g,
103 - tegur milligrammidele üleminekuks.
Lükopeen:
= 2,86 mg
Kepsantiin:
= 5,18 mg
Järeldus

• Kapsantiin on karotenoidide hulka kuuluv  pigment , kristalliline punane lipiidide lahustuv toiduvärv. Kapsantiin saadakse paprika „Capsicum“ ekstraheerimisel.
  
• Lükopeen ehk lükopiin on karotenoidide hulka kuuluv pigment. Suure lükopeenisisaldusega puu- ja juurviljade seas on hiina kibekurk,  tomatid , arbuus, roosa  greip, roosa guajaav,  papaia , astelpaju, godži marjad  ja kibuvitsamarjad.
  

Katse arvutus näitab, et lükopeeni sisaldus paprikas on 2,86mg% , mis tähendab, et 100 g paprika ekstraktis on 2,86 mg lükopeeni; kepsantiini sisaldus paprikas on 5,18 mg%, mis tähendab, et 100 g paprika ekstraktis on 5,18 mg kapsantiini. Kapsantiini on rohkem paprikas ja kirjanduse järgi leidsin, et paprikas kapsantiini sisaldus varieerub 2,19 - 3,49 mg/ 100g ja lükopeeni 1,49 mg/100g , mis on vähem, kui näitab katse tulemus. Kirjanduse andmed erinevad katse andmetest, see võiks tekkida kirjanduse ebausutavusest või katse ebatäpsusest.
Kasutatud kirjandus
http://lifebio.wiki/каротиноиды
https://www.ajol.info/index.php/ajbr/article/view/108940