1.3 Lipiidid ja 2.2 Karotenoidid (0)

Tallinna Tehnikaülikool
YKL0060  Biokeemia  
Töö nr 1.3 Lipiidide reaktsioonid
Töö nr 2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse 
määramine
Yasb  21
Juhendaja  Tiina  Randla
09.03.2012
1.3 Lipiidide reaktsioonid
Lipiidid  on heterogeenne rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti 
estersidemete esinemine. Lipiidid lahustuvad apolaarsetes orgaanilistes solventides nagu 
kloroform, benseen,  eeter  jt. Vähesel määral lahustuvad polaarsetes solventides, nt etanool. 
Selline lahustuvus on tingitud hüdrofoobsete rühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide 
sisaldusest. Lipiidid on membraanide põhiliseks koostisosaks, taimsetes  kudedes 
energeetiliseks varuaineks, neil on kaitse- ja regulatoorne funktsioon (sigaalmolekulid) ja 
omavad rolli hormonaalses tasakaalus. 
Lipiide  rühmitatakse:
•  rasvhapped
•  rasvad
• glütserofosfolipiidid
•  sfingolipiidid
• steroidid
•  terpenoidid
• vahad
Seebistumisvõime kohaselt jaotatakse:
• seebistuvad: rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad
• mitteseebistuvad:  steroolid , prostaglaniidid, terpenoidid
Rasvad (ehk triatsüülglütseroolid, neutraalrasvad, triglütseriidid) on ehituselt rasvhapete 
glütserüülestrid. Hüdrofoobsed rasvamolekulid sobivad toiduenergia säilitamiseks, olles 
loomades  akumuleerunud rasvapooridesse, kõrgemates taimedes seemnetesse. Naturaalsetes 
rasvades sisalduvad erinevad küllastunud ja küllastumata rasvhapped. Inimesele on olulised 
linool- ja α- linoleenhape , kuna neid inimorganism ei sünteesi ja peab saama toidurasvaga. 
Looduslikud küllastumata rasvhapped on valdavalt cis-konfiguratsioonis, mistõttu on ahela 
kuju väändunud. Trans- konfiguratsioonis küllastumata rasvhapped on organismides raskesti 
metaboliseeritavad ja peetakse südame- veresoonkonna  haiguste  tekitajaks .
Glütserofosfolipiidid on amfifiilsed, sest lisaks kahele rasvhappe radikaalile, mis annab 
molekulile hüdrufoobsuse, sisaldavad nad fosforhappe jääki. Glütserofosfolipiidid  on 
rakumembraanide  peamine  koostisosa . Fosforhappe jäägi kaudu seonduvad aminoalkoholid, 
mille järel moodustub molekulis  polaarne  tsenter. Seetõttu saavad lipiidid  moodustuda  
vesikeskkonnas struktuure, nt membraanid, vesiilikud jne. 
Steroolides esineb C-3 asendis hüdroksüleeritud steraanituum, mille tõttu nad moodustavad 
rasvhapetega estreid, mida tuntakse steriidide nime all. Levinuimad steroolid on loomne 
kolesterool , mida leidub pea kõikide loomsete rakumembraanide koostises ja mis tagab 
membraanide läbitavuse ja liikuvuse/voolavuse. Sellest toodetakse sapphappeid, 
steroidhormoone ning D-vitamiini. Taimerakkude membraanides on sarnast funktsiooni 
täitvate steroolide ehk fütosteroolide esindajad   ergosterool , stigmasterool, kampesterool jt. 
Need erinevad kolesteroolist C-17 asendusrühma ehituse poolest. Mitmetes taimedes on 
fütosteroolide sisaldus märkimisväärselt kõrge. Fütosteroolidele omistatavat  positiivset  toimet 
inimorganismidele põhjendatakse asjaoluga, et nad takistavad kolesterooli imendumist.
  
1.3.1 Rasvapleki  proov
Lipiid  lahustuvad orgaanilistes solventides. Lipiidi sisaldava lahuse tilga  kandmisel paberile 
ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk, millest 
paberi läbipaistvus suureneb (vastu valgust vaadates paberist heledam, pimeda poole vaadates 
tumedam )
Töö käik: Kahte kuiva katseklaasi pannakse 1 g uuritavat tahket ainet. Katseklaasidesse 
lisatakse orgaanilist solventi ( atsetooni ). Loksutatakse  ning lastakse settida 5 min. Kui 
sademe kohale on settinud selge lahuse kiht, siis kantakse mõlemast katseklaasist tilk lahust 
filterpaberile ja lastakse kuivada. Kuiva paberit vaadatakse vastu valgust ja varju suunas.
Järeldus: Orgaanilise solvendi lisamisel lipiid lahustus. Filterpaberile kandes ja kuivatades 
oli selgelt näha, et üks lahus muutis paberi läbipaistvust. Pärast teise lahuse kandmiset 
paberile ja kuivatamist muutub paber endiseks . Lipiidid sisaldusid proovis nr 2. 
1.3.2 Emulsioonitest 
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide 
nime all.  Kolloidid  koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud 
mikroskoopiliste tilgakestena teises  vedelikus . Kuna emulsioonid hajutavad valgust, siis 
emulsiooni  moodustumisest saab aru, kui lahus muutub häguseks. 
Kui  orgaanilises  solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse keskkonda ja seda 
loksutada , siis moodustub õli-vees tüüpi  emulsioon . Emulsioonid on levinud toiduainete 
valdkonnas (piim), autotööstuses (lateksvärvid).
Töö käik: Kahte kuiva katseklaasi lisatakse 1 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks 
sisaldab lipiide. Katseklaasi loksutatakse homogeense lahuse moodustumiseni, seejärel 
lisatakse mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutatakse intensiivselt. Jälgitakse,  kumb  
katseklaas  muutub häguseks. 
Järeldus: Pärast vee lisamist ja loksutamist, oli selgelt näha, et uuritavast proovist nr 1 
moodustatud lahuses olid lipiidid. Lahus muutus häguseks, läbipaistmatuks. Seal esinevad 
lipiidid ei lahustunud veel, vaid moodustasid vees mikroskoopilisi tilgakesi. 
1.3.3 Akroleiiniproov
Glütserooli kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga 
küllastamata aldehüüd  akroleiin . Sama reaktsiooni annavad teisedki glütserooli sisaldavad 
ained (ei anna vahad, sfingolipiidid jt). Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, 
kas tegemist on glütserooli sisaldava lahusega või mitte.
Töö käik: Kahte kuiva katseklaasi pannakse 1 g KHSO4 või  NaHSO4  ja lisatakse mõni tilk 
kahest  erinevast  uuritavast materjalist ( proov nr 1 ja nr 2). Katseklaase kuumutatakse 
tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulamise ja proovi tumenemiseni. Viimane  annabki  
märku reaktsiooni toimumisest ja akroleiini moodustumisest. Nuusutatakse ettevaatlikult 
katseklaasidest eralduvat lõhna (NB! Akroleiin on mürgine!), tõmmates käega katseklaasi 
kohalt õhku enda suunas ja tehakse järeldus, kumb proovidest sisaldas lipiidi, mille koostisse 
kuulub glütserool.
Järeldus: Alustasin kuumutamist prooviga nr 2, see lõhnas kõrbemise järele ning ei saanud 
aru, kas nii lõhnabki akroleiin. Aga pärast proov nr 1 kuumutamist eraldus tugev ja terav lõhn, 
millest järeldasin, et uuritavas proovis tekkis akroleiin ning järelikult sisaldas proov nr 1 
glütserooli.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse reaktsiooni 
halogeenidega. Küllastunud  rasvhappeid  sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimase 
pruun  värv lahjeneb, samas küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva 
liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik: Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse 2 ml (2% -list) erineva lipiidi 
lahust orgaanilises  lahustis : palmithappe, rapsiõli, searasva lahus. Kõigisse katseklaasidesse 
lisatakse tilkhaaval võrdne kogus (kuni 5 tilka) 5% -list  broomi  lahust kloroformis, 
loksutatakse ning jälgitakse toimuvaid muudatusi. Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks 
broomi lahus säilitama iseloomuliku  kollakas -pruuni värvi, teises kahes toimub värvi muutus. 
Tehakse järeldused uuritavate lipiidide  proovide  küllastumatuse kohta. 
Järeldus: Searasva ja rapsiõli sisaldavad  lahused  muutusid värvituks. Järelikult need 
lahused ei sisaldanud küllastumata rasvhappeid. Palmithappe lahus värvus orunžikas-
pruuniks. Neis toimus broomi liitumine küllastumata rasvhappele ning see tõestas 
küllastumata rasvhappe sisalduse uuritavas lahuses. 
Oliiviõlis sisaldub kirjanduse alusel 80% küllastumata rasvhappeid, millest oleiinhapet on 
71%. Searasvas sisaldub 63% küllastumata rasvhappeid.  
Palmitiinhape ei ole küllastumata  rasvhape  vaid küllastunud rasvhape, mille struktuur on 
toodud all.
Tabelis on toodud erinevates rasvades ja õlides sisalduvate küllastunud ja küllastumata 
rasvhapete protsentuaalsed koostised.
Rasvhappeline koostis, %
Rasv
Küllastunud
Küllastumata
C4 – C12
C14
C16
C18
C16 + C18
Piimarasv
10
11
29
10
40
Searasv
2
24
11
63
Veiserasv
2
2
29
21
46
Oliiviõli
2
2
13
3
80
Päevalilleõli
5
2
93
Maisiõli
2
10
3
85
Kookosrasv
60
18
11
2
8
Palmirasv
2
40
6
52
Rapsiõli
4
2
94
1.3.5 Liebermann-Burchard`i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskonnas 
moodustub tume  sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise 
reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. 
Reaktsiooni sinakas-rohelises  staadiumis  on TMR-meetodil identifitseeritud kuni 20 
reaktsiooniprodukti, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: 
steraanituuma oksüdeerimine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine 
erinevates punktides. Kokkuvõttes tekib kolesterooli polügeensete sulfoonhappe derivaatide 
segu. 
Töö käik: Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse 2 ml erineva lipiidi lahust 
metüleenkloriidis: kolesteroolilahust, oliiviõli ja searasva lahust. Igasse katseklaasi lisatakse 6 
tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4 tilka konts. väävelhapet ning loksutatakse hoolikalt. 
Jälgitakse katseklaasides toimuvaid muudatusi ning reaktsioonisegu lõpliku värvuse 
kujunemist. Tehakse järeldus kolesterooli sisalduse kohta uuritavates proovides. 
Järeldus: Kolesteroolilahus värvus pruunikaks, oliiviõli lahus muutus oranžikaks ning 
searasva lahuses võis  vaevu  märgata värvimuutust. Nende tulemuste põhjal järeldan, et 
kolesteroolilahus sisaldas kõige rohkem kolesterooli, seejärel oliiviõli ning kõige vähem 
searasva lahus. Kuid teadmiste põhjal peaks searasva lahuses olema kolesterooli märgatavalt 
rohkem. Selline tulemus võis tulla saastunud proovide tõttu või juhtus midagi katsete käigus, 
mis mõjutas kolesterooli sisaldust.  
Kolesterool on loomne sterool. Oliiviõlis kolesterool puudub. Taimedes on kolesterooliga 
sarnase funktsiooni täitmiseks steroolide hulka kuuluvad ergosterool, stigmasterool, 
kampesterool jt. Need kõik erinevad üksteisest C-17 asendusrühma poolest, kuid antud 
reaktsioonis C-17 positsioonis paiknev süsivesinikradikaal ei osale.
Reaktsioonil annab värvuse kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe 
keskkonnas tekkiv kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu.
2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja 
sisalduse määramine
Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides sisalduvad fotosünteesi abipigmendina 
karotenoidid . Need absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ja 
on seega täiendavateks kiirguse retseptoriteks. Karotenoidid klassifitseeritakse tetraterpe-
noidideks (40 C-aatomit).  Struktuurilt  on polüeensed, mille ühes või mõlemas otsas on 6-
liikmelised  ionoontsüklid. Karotenoide jaotatakse:
• karoteenid – O mittesisaldavad molekulid, koosnevad ainult C-st ja H-st, esindajateks 
on α -, β -, γ -, δ -, ζ – jt isomeerid, samuti pikima ahelaga lükopeen
• ksantofüllid – O sisaldavadmolekulid, esindajateks  luteiin , zeaksantiin jt
Karotenoidid täidavad kaitserolli – neelavad liigset valgusenergiat ja  kaitsevad  rakke 
fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest. Loomsetele organismidele on α -, β -, 
γ – karoteen  ning β-krüptoksantiin  vitamiin  A eeldusühendiks. Vitamiin A tagab nägemise, 
luues selleks fotokeemiline aluse; toimib antioksüdandina; kaitseb UV-ja sinise kiirguse eest; 
osaleb rakkudevahelises  suhtluses . Loomorganismid saavad karotenoide taimedelt. 
Karotenoidid on värvilised (kollasest punaseni). Karotenoidide võime neelata valguskiirgust 
nähtavas osas tuleneb nende molekulide ehitusest, mida iseloomustab polüeensus, st  molekul  
koosneb pikast, konjugeeritud, kaksiksidemeid sisaldavast süsivesinikahelast. 
Karoteeni  α-, β- ja γ-isomeeridest omab suurimat tähtsust β-karoteen (punakasoranž), mille 
molekul loomorganismis poolestub, andes 2 retinooli ehk vitamiin A1 molekuli.
β-karoteen on kristalliline aine sulamistemperatuuriga 183-184 oC, mis vees ei lahustu. 
Etanoolis  lahustub karoteen piiratud ulatuses, kuid lahustub hästi apolaarsetes orgaanilistes 
lahustites . Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma.
Paljude konjugeeritud kaksiksidemete tõttu neelab β-karoteen valgust spektri nähtavas osas. 
Seetõttu saab karoteeni sisaldust uuritavas  materjalis  objektiivselt iseloomustada 
neeldumisspektri järgi. 
Puhtal karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri 
sinises piirkonnas 450 ja 480 nm juures.
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse 
neeldumisspektri järgi. See kujutab endast  absorbtsiooni  (A) e optilise tiheduse (D, OD) 
sõltuvust uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest λ.
Töö käik: Kaaluda taimne materjal. Uhmerdada proov pestud liivaga ühtlaseks massiks. 
Lisada väikeste kogustena veevaba Na2SO4 kuni on moodustunud pulbriline mass. Lisada 
pulbrile väikeste koguste kaupa ekstrahenti (oktaan). Uhmerdada ning lasta sademel settida, 
selle kohal olev  ekstrakt  kanda teelusikaga filtrile (ekstrakt koguda mõõtesilindrisse). 
Protsessi  korrata  kuni sademe kohal olev ekstraks muutub värvituks. Kõik ekstraktid 
kogutakse  samasse  nõusse, määratakse kindlaks  ekstrakti   kogumaht  ja võetakse 
neeldumisspekter. Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350-
650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (ekstrahenti).
Tulemused:
Neeldumisspektri maksimumid:
447,5 nm D=0,6426 
473,0 nm D=0,8838
505,0 nm D=0,7256
E 1%
1cm
=3450
V = 8,2 ml
Kirjanduse alusel domineerib 
tomatites lükopeen 
maksimumidega 446, 474, 506
d = 0,704 g/cm3
Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs)
Kus
A – absorbtsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile
λmax – (kõrgeimale „tipule“vastav A väärtus)
E 1%
1cm
  - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsent (1%-lise karotenoidi lahuse 
absorbtsioon) sama λmax juures
V – ekstrakti kogumaht, ml
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g
103 – tegur milligrammidele üleminekuks
Tomatis sisaldub 1,422 mg lükopeeni 100 g tomati kohta. Kirjanduse alusel sisaldab värske 
tomat  2,573-3,025 mg lükopeeni.
Tomati muudab tervislikuks just lükopeenide kõrge tase, mis lisaks tervislikkusele annab  
tomatile ka väga ilusa ja punase värvi. Lükopeen ehk tomati pigment kuulub ise  karotinoidide   
„perekonda“.  Karotinoide  leidub taimede lehtedes, juurikates ja viljades, põhjustades nende  
kollast ja oranži värvust. Lükopeenid on ühed tugevamad looduslikud antioksüdandid.  
Antioksüdandid aitavad kaitsta rakke vabade radikaalide eest, mis võivad kahjustada raku 
tuumas olevat pärilikkuseainet DNA-d. Lükopeen suudab takistada või likvideerida vabade 
radikaalide  kahjulikku  toimet organismile. Samuti kaitsevad lükopeenid silma võrkkesta 
kollatähni taandarengut, mis on üks peamisi nägemiskaotuse põhjuseid arenenud riikides. 
Järeldus:  Kromatograafia  alusel sisaldub tomatis karotenoidina lükopeen. Arvutuste põhjal 
oli lükopeeni sisaldus tomatis 1,422 mg%. Lükopeen on kirjanduse aluseks domineerivaks 
karotenoidiks ning selle sisaldus on 2,573-3,025 mg%.