Karotenoidid ja lipiidid (2.2 ja 1.3) (0)

2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine

1. Töö teoreetilised alused

Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides ning teistes fotosünteesivates organismides sisalduvad fotosünteesi abipigmentidena karotenoidid . Need absorbeerivad valgust klorofüllist erinevatel lainepikkustel ja on seega täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Karotenoidid on arvukas ühendite rühm, millised keemiliste ehituse poolest klassifitseeritakse kui tetraterpenoide. Struktuurilt on nad polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on ionoontsüklid. Pikima ahelaga karotenoid on lükopeen, mis on tähtsaks vaheühendiks paljude teiste karotenoidide sünteesis. Karotenoidide kaks põhigruppi on karoteenid (hapnikku mittesisaldavad, koosnevad ainult süsinikust ja hapnikust, nt lükopeen) ja ksantofüllid (hapnikku sisaldavad, nt luteiin , zeaksantiin).
Lisaks valguse absorbeerimisele on karotenoididel taimedes ka kaitsev roll, neelates liigset valgusenergiat ning kaitstes rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
Loomsetele organismidele on - karoteen ning -krüptoksantiin vitamiin -A eelühendiks. A-vitamiini põhiliseks funktsiooniks on nägemisprotsessi tagamine, luues selleks fotokeemilise aluse, lisaks on ta ka antioksüdant.
Karoteeni isomeeridest omab suurimat tähtsust -karoteen, mis ei lahustu vees, kuid lahustub orgaanilistes lahustes.
Kõik karotenoidid on värvilised, kuid värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Karotenoidide võime neelata valguskiirust spektri nähtavas osas (400-700nm) tuleneb nende molekulide ehitusest, mida iseloomustab polüeensus, molekul koosneb pikast konjugeeritud kaksiksidemetega süsivesiniku ahelast.
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi, mis kujutab endast absorptsiooni sõltuvust uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest.
Selle laboratoorse töö eesmärgiks on karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest ja saadud karotenoidide neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril. Selle alusel analüüsitakse uuritava materjali karotenoidset koostist ja määratakse domineeriv karotenoid antud objektis.

2. Töö käik

Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist

• Eelpeenestatud taimsest materjalist kaalutakse tehnilistel kaaludel proov (0,5-2 g). Minu töös oli uuritavaks taimseks materjaliks tomat , mille kaalutis oli 0,65 g.
  
• Eelpeenestamisele järgneb lõplik peenestamine uhmris . Selleks viiakse proov kaaluklaasist ilma kadudeta uhmrisse, lisatakse väike kogus liiva ning hõõrutakse uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni.
  
• Seejärel lisatakse väikeste portsjonitena veevaba naatriumsulfaati, et taimses materjalis vett siduda. Jätkatakse massi hõõrumist. Soola lisamine tuleb lõpetada, kui on moodustunud kuiv pulbriline mass.
  
• Järgneb karotenoidide ekstraktsioon proovist orgaanilise lahustiga, milleks antud töös oli petrooleeter . Ekstrakti kogumiseks võtsin 25-ml mõõtsilindri, mille varustasin lehtri ja kuiva filterpaberiga. Siis alustatakse ekstraktsiooni, lisades peenestatud massile väikeste koguste kaupa ekstrahenti. Teelusika abil kantakse sademe kohal olev ekstrakt filtrile. Seda tegevust korratakse, kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. Määratakse ekstrakti kogumaht , milleks tuli 10,5 ml.
  

Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs
Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350-650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit ehk ekstrahenti.
Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näidatakse ära ja märgitakse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid ja vastavad absorptsiooni täpsed väärtused:
Lainepikkus
Optiline tihedus A
1.
445,5 nm
0,478 A
2.
471,5 nm
0,669 A
3.
502 nm
0,561 A
Neeldumisspektrid:
Leitud neeldumisspektrid sarnasesid enim lükopeeni neeldumisspektritega, millised teatmeteoses olid järgmised: 446, 474 ja 506 nm.
Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs)
Karotenoidi sisaldus (K, mg%) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt valemile:
A - absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumismaksimumile (kõrgeima tipu)
- vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient
V - ekstrakti kogumaht, ml
d - kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3
g - uurimiseks võetud taimse materjali mass, g
103 - tegur milligrammidele üleminekuks
Minu andmed:
A = 0,669
= 3450
V = 10,5 ml
d = 0,69 g/cm3
g = 0,65 g

3. Tulemused

Tomat sisaldab karotenoididest kõige enam lükopeeni ning see selgus ka minu katsest. Kirjanduse alusel sisaldab tomat umbes 8,8-42 mg/g ehk 0,88-4,2 mg% lükopeeni. Minu saadud tulemus vastab kirjanduslikule, järelikult võib katse lugeda õnnestunuks.

3.1 Lipiidide reaktsioonid

1. Töö teoreetilised alused

Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersidemete esinemine. Lipiidid ei lahustu vees ega vesilahustes, küll aga apolaarsetes orgaanilistes solventides, nagu kloroform, benseen, eeter , jt. Lahustumatus vees on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis.
Lipiide võib vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele klassifitseerida nii: rasvhapped , rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad, steroidid, terpenoidid .
Rasvad ehk triatsüülglütseroolid on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Hüdrofoobsed rasvamolekulid sobivad toiduenergia säilitamiseks, loomades talletatakse see rasvadepoosse, kõrgemates taimedes seemnetesse. Naturaalsed rasvad sisaldavad nii küllastunud kui küllastumata rasvhappeid. Linool - ja -linoolhape on asendamatud, kuna neid inimorganism ise ei sünteesi. Looduslikud küllastumata rasvhapped on reeglina cis-konfiguratsioonis. Trans-konfiguratsioonis on küllastumata rasvhapete ahelad sik-sak-kujuga ja seetõttu käituvad biomembraanides sarnaselt küllastunud rasvhapetele.
Rakumembraanide peamiseks koostisosaks on glütserofosfolipiidid, mis on amfifiilsed molekulid, sest lisaks kahele rasvhappe radikaalile sisaldavad nad fosforhappe jääki.
Steroolide ehituslikuks aluseks on steraanituum, mis on C-3 asendis hüdroksüleeritud. Levinuim sterool on kolesterool, mida leidub pea kõikides loomsetes rakumembraanides. Taimerakkude membraanides täidavad sarnast funktsiooni fütosteroolid, nt ergosterool, stigmasterool, jt.

2. Katsed

1.3.1 Rasvapleki proov
Kõikide lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites . Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb.
Töö käik
Uuritakse kahte tahket materjali, millest üks sisaldab lipiide.

• Võetakse 2 kuiva katseklaasi, millesse pannakse umbes 1g tahket ainet.
  
• Mõlemasse katseklaasi lisatakse lisatakse mitte rohkem kui 0,5 ml orgaanilist lahustit, milleks antud katses on atsetoon .
  
• Loksutatakse hoolikalt ja lastakse tahke materjali settimiseks seista umbes 5 minutit.
  
• Kui lahuse kohale on tekkinud selge lahusekiht, siis kantakse mõlemast katseklaasist tilk lahust filterpaberile ja lastakse kuivada.
  
• Kuiva paberit vaadatakse vastu valgust ning varju suunas
  

Esimesest proovist võetud lahusest tekkis paberile rasvaplekk, järelikult sisaldas esimene proov lipiide.
1.3.2 Emulsioonitest
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus . Emulsiooni moodustumisest annab märku selge lahuse hägustumine. Rasvad lahustuvad orgaanilistes solventides ning kui sellises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja intensiivselt segada, siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .
Töö käik

• Kahte kuiva katseklaasi valatakse 2 ml 96%-list etanooli ja lisatakse 2 ml erinevat lahust, millest üks sisaldab lipiidi ja teine mitte.
  
• Katseklaase loksutatakse kuni homogeense lahuse moodustumiseni.
  
• Seejärel lisatakse mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutatakse intensiivselt.
  

Kuna teise katseklaasi tekkis hägu, mis andis märku emulsiooni moodustumisest, siis sisaldas see lahus lipiide.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse reaktsioone halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll veidi lahjeneda, kuid ei kao. Küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumisreaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik

• Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis : rasvhappe, taimse rasva ja loomse rasva lahust.
  
• Kõigisse katseklaasidesse lisatakse tilkhaaval võrdne kogus (kuni 10 tilka) broomi broomi lahust kloroformis, loksutatakse ning jälgitakse toimunud muutusi
  

Esimesse katseklaasi valasin palmithapet ning broomi lisamisel jäi lahus kollakas -pruuniks, millest järeldub, et tegemist oli tõepoolest küllastunud rasvhappega.
Teise katseklaasi valasin taimse rasvana rapsiõli, mis muutus reaktsioonil broomiga värvusetuks ja seetõttu saab väita, et rapsiõli sisaldab küllastumata rasvhappeid.
Kolmandasse katseklaasi valasin või lahust, mis muutus broomi lisamisel oranžiks, järelikult ei sisaldunud või küllastumata rasvhappeid.
1.3.5 Liebermann -Burchard’i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Sinakas-rohekas staadiumis tekkinud reaktsiooniproduktid näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset mitmeid muutusi. Toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Kokkuvõttes tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu.
Töö käik

• Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis: kolesteroolilahust, taimse ja loomse rasva lahust.
  
• Igasse katseklaasi lisatakse 6-7 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilka kontsentreeritud väävelhapet, loksutatakse hoolikalt.
  

Esimesesse katseklaasi panin kolesteroolilahust, mis äädikhappe anhüdriidi ja väävelhappe lisamisel muutus pruunikas-rohekaks.
Teise katseklaasi valasin rapsiõli. Äädikhappe anhüdriidi ja väävelhappe lisamisel jäi lahuse värvus samaks, millest võib järeldada, et rapsiõli ei sisalda kolesterooli.
Kolmandasse katseklaasi valasin searasva lahust ning selle värvus muutus äädikhappe anhüdriidi ja väävelhappe lisamisel samuti pruunikas-rohekaks, mis näitas, et searasva lahus sisaldas ka kolesterooli.