TTÜ Biokeemia praktikum: Lipiidid, Karotenoidid (0)

TÖÖ 1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
TÖÖ 2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
Juhendajad:
Kaia Kukk
Priit Eek
1.3 Lipiidide reaktsioonid
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersideme(te) esinemine. Reeglina ei lahustu lipiidid vees ja vesilahustes, vaid apolaarsetes orgaanilistes solventides, nagu triklorometaan (kloroform), tetraklorometaan, benseen , eeter jt. Lipiidide lahustumatus vees ja vesilahustes on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesikinradikaalide sisaldusest molekulis.
Lipiidid on organismides rakumembraanide põhiliseks koostiskomponendiks, loomsetes organismides, aga ka mitmetes taimsetes kudedes peamiseks energeetiliseks varuaineks. Lisaks sellele on neil ka kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid, nad on signaalmolekulideks ning mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus.
Lipiide rühmitatakse:

• rasvhapped
  
• rasvad
  
• glütserofosfolipiidid
  
• sfingolipiidid
  
• vahad
  
• steroidid
  
• terpenoidid
  

Seebistumisvõimest lähtudes võib neid jaotada seebistuvateks ja mitteseebistuvateks lipiidideks.
1.3.1. Rasvapleki proov
Kõigi lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb.
Töö käik
Uuritakse kahte tahket materjali, millest üks sisaldab lipiide.

• Võetakse 2 kuiva katseklaasi, millesse pannakse umbes 1g tahket ainet
  
• Katseklaasidesse lisatakse mitte rohkem kui 0,5 ml atsetooni
  
• Loksutatakse hoolikalt ja lastakse tahkel materjalil settida
  
• Katseklaasidest kantakse pipetiga tilk filterpaberile ja lastakse kuivada
  
• Kuivi filterpabereid vaadatakse vastu valgust
  
• Esimese proovi paber paistis paremini läbi, seega sisaldas see lipiide
  

1.3.2. Emulsioonitest
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamfaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena (dispergeerunud faas) teises vedelikus (pidevas faasis). Kuna emulsioonid hajutavad valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.
Rasvade iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes. Kui orgaanilises lahustis valmistatud rasvalahus viia vette ja seda intensiivselt segada, moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .
Töö käik

• Kahte kuiva katseklaasi valatakse 2 ml 96% etanooli
  
• Lisatakse 2 ml kahte uuritavat lahust ja loksutatakse
  
• Mõlemasse katseklaasi lisatakse 4 ml destilleeritud vett ja loksutatakse (ei mäleta, aga usun, et tegin just nii)
  
• Teises katseklaasis tekkis hägu ehk õli-vees emulsioon, seega sisaldas teine lahus lipiide
  

Küllastumata rasvhapete tuvatamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisele reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll lahjeneda, kuid ei kao. Küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus liitumisreaktsiooni tõttu värvituks.
Töö käik

• Kolme puhtasse katseklaasi pipeteeritakse 2 ml lipiidide lahuseid orgaanilises lahustis: rasvhape (palmitiinhape), taimne rasv (rapsiõli) ja loomne rasv (searasv)
  
• Kõigisse katseklaasi lisatakse 10 tilka broomi lahust kloroformis, loksutatakse
  
• Rasvhappe lahuses jäi broom pruunikaks, värvus eriti ei muutunud, seega on palmitiinhape küllastunud rasvhape
  
• Taimse rasva lahus muutus värvituks, mis näitab suurt küllastumata rasvade osakaalu
  
• Loomse rasva lahus jäi veidi punakaks, st loomses rasvas on rohkem küllastunud rasvu kui taimses rasvas.
  

Kirjanduse põhjal on rapsiõlis küllastunud rasvu 6%, monoküllastumata rasvu 62% ja polüküllastunud rasvu 32%. Searasvas on vastavad arvud 41%, 57% ja 2%.
1.3.5. Liebermann – Burchard’i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas-roheline reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Lõpuks tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu.
Töö käik

• Kolme puhtasse katseklaasi pipeteeritakse2 ml kolesterooli, taimse rasva (oliiviõli) ja loomse rasva (searasva) lahust metüleenkloriidis
  
• Igasse katseklaasi lisatakse 6...7 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4...5 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning loksutatakse
  
• Kolesterooli sisaldav lahus muutus sinakasroheliseks
  
• Oliiviõli sisaldav lahus muutus veidi rohekaks, kuid kuna see on taimne rasv, näitab see hoopis fütosterooli sisaldust
  
• Searasva sisaldav lahus jäi peaaegu värvitus, mis tähendab, et searasvas on väga vähe kolesterooli
  

2.2. Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides, aga ka mõningates teistes fotosünteesivates organismides sisalduvad fotosünteesi abipigmentidena karotenoidid . Viimased absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ja on seega täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Struktuurilt on karotenoidid polüeensed ahelad , mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid. Karotenoidide kaks põhitüüpi on

• karoteenid – hapnikku mittesisaldavad molekulid ( karoteeni isomeerid, lükopeen)
  
• ksantofüllid – hapnikku sisaldavad molekulid ( luteiin , zeaksantiin)
  

Taimedes täidavad karotenoidid lisakas ka kaitsvat rolli, neelates liigset valgusenergiat ja kaitstes rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
Loomsetele organismidele on neli karotenoidi, α-, β- ja γ-karoteen ning β-krüptoksantiin, vitamiin A eelühenditeks. β-karoteenist tekib kaks, α- ja γ-karoteenist ning β-krüptoksantiinist üks retinaali molekul . Karotenoidide konverteerumine retinaaliks toimub soole mikrofloora poolt produtseeritava ensüümi, karoteeni oksügenaasi, toimel.
Kõik karotenoidid on värvilised, kusjuures värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas (400-700 nm) tuleneb nende molekuli ehitusest, mida iseloomustab polüeensus, st molekul koosneb pikast, konjugeeritud kaksiksidemeid sisaldavast süsivesinikahelast.
Uuritava matejali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi.
Töö käik
Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist

• Tehnilisel kaalul kaalutakse 0,65 g peenestatud tomati viljaliha ( soovitatud 0,6 – 0,7 g)
  
• Proov viiakse kadudeta uhmrisse
  
• Proov peenestatakse uhmris, kasutades abrasiivmaterjalina pestud liiva
  
• Lisatakse väikeste portsjonitena veevaba Na2SO4, et siduda vesi
  
• Võetakse 25ml mõõtsilinder lehtri ja paberfiltriga
  
• Ekstraheeritakse karotenoidid, kasutades lahustina petrooleetrit (ρ = 0,69 g/ml)
  
• Uhmris olevale massile lisatakse ekstrahenti, segatakse ja ekstrakt viiakse metalllusikaga filtrile
  
• Protsessi korratakse, kuni ekstrakt on värvitu
  
• Ekstakti koguti 16 ml
  

Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs

• Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse vahemikus 350 –600nm
  
• Võrdluslahusena kasutatakse puhast petrooleetrit
  
• Spektrofotomeetri ekraanile joonistub neeldumisspekter, millel märgitakse ära iseloomulikud neeldumismaksimumid ja nendele vastavad optilise tiheduse väärtused
  
• Neeldumismaksimumid:
  
  • 445,5 nm, 0,2659
    
  • 470,0 nm, 0,3481
    
  • 500,5 nm, 0,2671
    
• Neeldumisspekter trükitakse välja
  
• Iseloomulikke neeldumismaksimume võrreldakse teatmeteostes leiduvate andmetega
  
• Kirjanduse põhjal on tegemist lükopeeniga ( tegelikud neeldumismaksimumid petrooleetris 505; 472; 446 nm. Vastavad E1cm1% väärtused: 3150; 3450; 2250)
  

Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs)
Sisalduse määramiseks uuritavas proovis kasutatakse neeldumisspektri analüüsimisel saadud andmeid – neeldumismaksimumine vastavaid absorptsiooni väärtusi. Reeglina võetakse aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektril kõige kõrgemale tipule. Arvutus põhineb nimetatud lainepikkusele vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsendi (karotenoidi 1%-liste lahuste absorptsiooni väärtus) väärtuse suhtele.

• A – neeldumisgraafikul kõrgeimale tipule vastav A väärtus
  
• E1cm1% - vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsent (1% karotenoidi lahuse absorptsioon )
  
• V – ekstrakti kogumaht ml
  
• d – kasutatud ekstrahendi tihedus g/ml
  
• g – uurimiseks võetud taimse materjali mass g
  

Järeldus: Uuritud tomat sisaldas karotenoidina põhiliselt lükopeeni, mille sisaldus oli 1,7mg%, mis tähendab, et 100 grammis tomatis on 1,7 milligrammi lükopeeni. Töö oli edukas ja saadud tulemus mahtus internetist leitud vahemikku.
Wikipedia põhjal on tomatite lükopeenisisaldus vahemikus 0,88 – 4,2 %.
( http://en.wikipedia.org/wiki/Lycopene )