Capillary electrophoresis i.k. (0)

Tallinn University 
Natural and exact sciences 
Molecular Biochemistry and Ecology 
  
 
 
 
 
 
   
Maria Gnidenko 
  
Capillary electrophoresis 
  
Essay  
  
  
  
   
  
 
Supervisor: Kert Martma 
 
  
 
 
 
 
 
Tallinn 
2015 
 
Table of contents 
Acronyms and  symbols  used 
Introduction  
History and  development  
Physical   basis  and principle of separation 
Elektrophoresis 
Electroosmotic flow 
Separation  process  
Electrodispersion 
Various methods of separation 
Capillary zone electrophoresis (CZE) 
Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC OR MEKC) 
Capillary Gel Electrophoresis (CGE) 
Capillary Isoelectric Focusing ( CIEF ) 
Isotachophoresis (ITP) 
Electrokinetic Chromatography (EKC) 
Micro Emulsion Electrokinetic Chromatography (MEEKC) 
Non­Aqueous Capillary Electrophoresis ( NACE ) 
Capillary Electrochromatography (CEC) 
Equipment  
Sample injection 
Electrokinetic injection (EI) 
Hydrodynamic injection (HI) 
Stacking 
Capillary 
Consitioning 
Thermal  regulation  
High  voltage   power  source 
Detection 
Absorption in the UV and  visible   region  
Notes  to the quantitative  analysis  
1 
CE equipment 
CE  application  
CE application in pharmaceutical analysis 
CE application in biopharmaceutical analysis 
CE application in biotechnology 
Conclusions and  perspectives  
New directions 
References 
 
Acronyms and symbols used  
API
Active  pharmaceutical ingredients 
CE
Capillary electrophoresis 
CIEF
Capillary Isoelectric Focusing 
CZE
Capillary zone electrophoresis 
EI
Electrokinetic injection 
EOF
Electroosmotic flow 
GC
Gas Chromatography 
HECE
High Efficiency Capillary Electrophoresis 
HPLC
High  Performance  Liquid Chromatography 
MEKC
Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography 
UV 
Ultraviolet  
 
Introduction 
Сapillary electrophoresis  is  a  relatively new   method  of analysis, which,  however , is rapidly 
develops.  It  is   suitable   for  separation  of  polar  and  ionic  samples  and  complements  the 
classical   separation  techniques   such  as  HPLC  (High  Performance  Liquid Chromatography) 
and  GC  (Gas  Chromatography).  All  electrophoretic  separation  methods  are   based   on  the 
principle  of   different   rates  of   migration   of  charged   particles   and  molecules  in  a   constant  
electric   field . 
2 
 
CE  (Capillary  electrophoresis)  combines  different  techniques  of  electrophoresis  and 
chromatography to  individual  method that provides separation with high r
  esolution i n a short 
time.  Additional  commercial  equipment  for  CE   offers   the  possibility of  automatic  sample 
introduction,  micropreparative  fraction   collection ,  computer  control   and  data  collection,  as 
well  as  the   registration   of  samples  by  Ultraviolet  (UV)­fluorescent,  electrochemical  or 
radiochemical detectors (Беккёр, 2009). 
 
History and development 
History of the electrophoresis started in 1807, when   professor  of the  Moscow U
  niversity, F
  . 
Reis   discovered   phenomena  such  as  electroosmosis  and  electrophoresis.  However,  the 
practical  use of this process in biology and  medicine  b
  egan much l ater and is a
  ssociated w
  ith 
the name of the chemistry Nobel Prize winner  Arne  Tizelius, who in the 30s  year  of the last 
century has  developed  a method of electrophoresis in free fluid and constructed a  device  for 
electrophoretic separation a
  nd a
  nalysis of p
  rotein m
  ixtures b
  y f
  ree o
  r  moving  boundaries. The 
main  disadvantage of  this method was the  heat  liberation  during  the electriс  current   passing  
through  the liquid b
  ecause that prevented for  clear   division  o
  f f
  actions a
  nd l ed to a
  b
  lurring of 
the boundaries  between   the individual   zones .  In  1940, D. Philpot suggested to use columns 
with a  density   gradient  of  buffer  solutions, and in the 50s  years  the method has been r
  efined 
and was developed the device for electrophoresis in density gradient. 
 
However, the  method  was  deficient, because after switching off the electric current,  formed  
during  electrophoresis  zones  have  "blurred".  Subsequent  achievements  in  electrophoresis 
associated with  the stabilization  establishment  of  zones in the  solid  support  medium . So, in 
1950,  as  a  solid carrier scientists began to use a  filter  paper, in 1955 it was proposed to use 
starch, and  already  in 1957,  Cohn  proposed to use as the solid support the  films  of cellulose 
acetate , which still remains one of the most  commonly  used carriers at clinical  studies . 
Almostly the  same  time has been developed a method in which agarose is used as the basis. 
In  1960  have  been  developed  a method of  capillary  electrophoresis and  only  in 1989 was 
created  and  put  into   practice   the   first   analyzer,  based  on  capillary  electrophoresis  method 
(Шевченко et al., 2006). 
3 
 
Physical basis and principle of separation 
The  principle of  separation  in  CE is based on the different electrophoretic migration 
of substances in an electric field. Principle of CE devices is v
  ery  simple  a
  nd is s
  hown i n F
  ig. 
1. Analysis sequence i s also very s
  imple.  Both  ends o
  f t he capillary with e
  lectrodes i mmersed 
in the electrolyte container. The c
  apillary i s f
  illed with b
  uffer, t o which the s
  ample  solution  i s 
applied  on  one  side.  Then,  sample   components   are separated by an applied voltage, as they 
move  in a buffer at different speeds. 
 
 
Fig. 1: Diagram of capillary electrophoresis system 
 
The  principle of  electrophoresis  is strictly  obeys  Ohm's  law. For the electrophoretic 
separation must be keeped a constant voltage. The buffer is needed t o  provide  an electrolytic 
conductivity.  In  capillary  convection  and  the  free  flow  are  minimized.   Therefore , 
high­performance  capillary  electrophoresis  can  be  carried  out in  the same  aqueous  buffer. 
Without   polyacrylamide  or  agarose  as a supporting matrix for electrophoresis, separation of 
substances  takes   place  in f ree solution, i .e. in t he "open" c
  apillary. S
  o in t his  case  w
  e speak o
  f 
so­called  free  zone  electrophoresis.   Necessary   for  this  separation   technology   devices  must 
4 
create  a  field   strength   of  200  to  400  V  /  cm  to  provide  sufficient  ion   mobility .  Voltage, 
depending on the capillary  length ,  lies  between 5
  a
  nd 2
  5 k
  V.  Typical   operating  p
  arameters o
  f 
capillary electrophoresis are presented in Table. 1. 
 
Table 1: Typical parameters of CE 
Inner  diameter  of the capillary 
20­100 μm 
Capillary lenght 
100­150 cm 
Voltage across the capillary 
10­30 kV 
Current  rate  
10­100 μA 
Field force 
100­500 W/cm 
Generated heat 
0,5­5 W 
Sample  volume  
1­50 nL 
 
CE  has  one  advantage  over  column  chromatography  processes . It is not necessary to 
wait   until   the  last   peak   will  cover  the   distance   to  the   exit   of  the  capillary,  as  after  each 
analysis, the capillary is washed with a special solution and  filled  with new buffer. 
Because  of  the  use  of  quartz  capillary  filled  with  buffer,  online­UV  detection  at 
wavelengths  up  to  200  nm  is possible.  The  advantage of   direct    passage   of a beam  of  light  
through  the  capillary  is  the  fact   that  in  this  case  there  is no  band  broadening caused by the 
detector cell and inlet capillaries. 
This  detection  does  not  introduce  additional  dead  space.  Its   drawback ,  however,  is  a small 
internal   diameter  of  capillaries  (from  25  to  100  micrometers).  Such  a  small  optical   path  
length,  according  to the   Beer ­Lambert  law,   results  only  a small absorption. Because of this 
constructive specificity,  particular  detection i n CE, c
  ompared t o  other  separation p
  rocesses, is 
insensitive method. 
Elektrophoresis 
Electrophoretic separation is based on different rates of migration in an electric field, at that 
the ion  velocity  ​
v is the p
  roduct o
  f its electrophoretic mobility μ​ and an applied electric f ield 
с 
E: ​
v= μ​
*E, where     
 
   ­ electrophoretic mobility; E ­ the a
  pplied e
  lectric 
с​
​
v ­ internal velocity; μ​
field. 
5 
The electric field  is a  function  of the applied voltage and t he length of the c
  apillary w
  ith the 
dimension of V / cm. Electrophoretic mobility of the ion in the medium  is a
  c
  onstant which 
is calculated by the equation:  μc = q , 
6πηr
where q ­ ion  charge ; η ­ viscosity of the solution; r ­ the radius of the ion 
Small   highly   charged  particles  have  high mobility;  large  particles  having a low charge, in 
contrast , have a low mobility. 
Moreover ,  the  electrophoretic  mobility  is   dependent   on  the  pH  of  the  solution.  The 
electrophoretic  mobility  is  shown  in  tables  as  a  physical  constant  defined  on   complete  
dissociation of the electrolyte and extrapolation to infinite dilution. H
  owever, in p
  ractice it is 
often  substantially different,  because  the  so­called effective mobility,  in  many   cases  highly 
dependent on the pH and  composition  of the used buffer. 
 
The  distinction  between  absolute  and  effective  mobility  is  explained  in  Fig.  2.  There  are 
shown two hypothetical solution, which on c
  omplete dissociation o
  f t he electrolyte, i .e. w
  hen 
α (degree of dissociation)=1 have the same mobility μ.  
 
Fig. 2: Mobility of two  weak  acids as a function of pH 
 
6 
According  to  the  absolute  mobility,  taken  from  the  tables,  both  of   these   substances seem 
inseparable because they migrate e
  qually. H
  owever, b
  oth these s
  ubstances have d
  ifferent p
  Ka 
values, i.e mobility is dependent on pH. 
Electroosmotic flow (EOF) 
Migration  of  substances depends  on the one  hand , on specific for compounds parameters as 
charge and  size , and on the other hand, it is  affected  by factors s
  uch as pH and ionic strength 
of  the   working   buffer,  the  field  strength  and  temperature.  Migration  is  complicated  by 
electroosmotic flow w
  hich i s caused b
  y c
  harges o
  n t he inner surface of t he capillary. EOF is a 
feature of a capillary electrophoresis and is not  observed  in conventional e
  lectrophoresis i n a 
flat  layer. 
Electroosmotic flow ­ is directed to the cathode stream of buffer. 
 
 
7 
Fig.  3:  ​
The  appearance  of  osmotic  flow:  a)  negatively  charged  surface  of  the  quartz;  b) 
hydrated  cations  adsorbed  on  the surface; c) solution migrates to the cathode due to electric 
field appearance 
 
 
Fig. 4: The profile of and corresponding profile of the chromatographic zone 
 
In aqueous solution, the majority of solid s
  urfaces h
  ave excess n
  egative charge w
  hich 
appear due to ionization of the surface due to a
  cid­ base  equilibrium a
  nd /  or a
  dsorption of t he 
ionized particles on the s
  urface. In the q
  uartz c
  apillaries c
  an o
  ccur both, h
  owever E
  OF mainly 
caused  by dissociation  of  silanol  groups (­SiOH),  which  exist  in the  anionic  form  SiO​
­​
, as 
shown in  Figure  3a. 
To  neutralize  the  charge  counter  ions  are  adsorbed  on  the  surface  and  form  an 
electrical    double   layer,  which   causes   a  potential  difference,  a  so­called  ζ­potential (Figure 
3b). If now apply a voltage, the cations of the diffuse double l ayer m
  igrate i n the d
  irection o
  f 
the cathode.   Since   cations are solvated, the solution  around   them  moves  along  with them in 
the direction of the cathode (Figure 3c). 
This electroosmotic flow does not obey to the l aw o
  f Hagen­Poiseuille about t he f
  low 
in  a capillary under   pressure .  It  differs from it by a very flat flow profile. Since the driving 
force along the capillary (i.e on i ts i nner w
  alls), i s h
  omogeneous, the p
  ressure drop a
   cross  t he 
8 
capillary  is absent. This  effect   explain  a very slight broadening of the bands observed in the 
CE (Fig. 4). 
Separation process 
Band  separation  in  zone  electrophoresis  is  based  on  a  combination  of  electrophoretic 
mobility and electroosmotic flow of ions. 
In electroosmosis effect voltage  value , ionic strength, viscosity of a buffer,  additives 
in   eluent  and different coatings  of  the  capillary  walls. Electrophoretic  mobility of   positive , 
neutral  and  negative  sample molecules is different, but all of the particles under t he effect o
  f 
electroosmotic flow migrate towards the cathode. 
The  rate  of  migration  of  the   particle   is  the  sum  of  its  own  electrophoretic  mobility  and 
electroosmotic flow rate. 
The  advantage  of  electroosmotic  flow  is  the  fact  that   almost   all  the  particles  are 
moving independently of the charge in the same d
  irection. I
  n normal conditions, i.e. c
  apillary 
surface is negatively charged, the flow moves from the anode to the cathode. The anions are 
also  moving  to  the  cathode,  as  EOF  may  is  measurable   greater    than   the  electrophoretic 
mobility.  That   means ,  that  cations,  anions  and  neutral  molecules  can  be  separated 
electrophoretically in a  single  analysis since they migrate in the same direction. 
● Cations  moved  most quickly, as  the  EOF and electrophoretic  movement   directed in 
the same direction to the cathode 
● The neutral molecules are transported at a  speed  of EOF, but not separated. 
● Anions  migrate  more  slowly as  they are  attracted  to the  anode,  but move under the 
influence  of EOF  toward  the cathode. 
 
Migration time is  determined  by a characteristic constant  of ion m
  obility a
  nd e
  lectroosmotic 
flow coefficients: 
, 
where V ­ velocity migration; L ­
   length of c
  apillary (
  the detector); t ​­  t ime of m
  igration; E ­ 
m
electric field strength; u​­ ion mobility; μ  ­ the coefficient of EOF. 
ion ​
​
EOF​
In the analysis of small ions (e.g., N
  aCl, KCl), their m
  obility i s u
  sually s
  o l arge t hat i s 
comparable to the EOF. An additional surface modification of capillary EOF c
  an be reduced 
9 
to  such  an  extent  that  the  movement  of  anions  and  cations  in  setting  direction  will  stop. 
Conventional   coating   of  capillaries  surface  with   linear   polymers  without  transverse 
cross­links eliminates electroosmosis, which is typical for uncoated capillaries. 
Electrodispersion 
The  peculiarity  of  capillary  electrophoresis  is  the  electrodispersion  (Figure  5). 
Because of this can be  seen  as symmetric  Gaussian  and triangular asymmetric peak shapes. 
While  the distorted shapes of the peaks with " front " and " tails " in the other c
  hromatographic 
process  can  be  eliminated  by  adoption  of  appropriate  measures, such  peaks  shapes  in  CE 
should be  considered  as normal. T
  hey a
  re caused b
  y t he  strong   differences  in t he conductivity 
of the sample and buffer. 
If  the  sample  has  a   higher   mobility  than  the  separation  buffer,  the  front  part of  the  zone 
becomes diffusive, and the  tail  of the band becomes sharper ("front" peak). On the contrary, 
at a lower mobility of the sample, than a buffer received acute frontal z
  one and diffusive e
  nd 
zone  ("tail"  of  the  peak).  Symmetrical  peaks are  observed  only  if  both the  conduction  are 
identical. 
 
 
10 
Fig. 5: Electrodispersion caused by varying conductivity of buffer and sample
 
Unsymmetrical peaks  are caused  by  different conductivity and, at the same time, by 
an electric field. If the sample has a higher mobility, i.e. higher conductivity than t he buffer, 
then on the both sides (on the front, and on the end of sample zone)  appears  excessive field 
gradient  in  the  transition  zone.  The  stress  gradient in the end zone of the sample is directed 
the same as the migration of t he sample, s
  o t hat t he sample c
  omponents in t ransition z
  one are 
accelerated  back  towards the transition z
  one. B
  ecause of t his, a
  ppears a
  s
  harp boundary a
  t the 
end of the peak sample.
 
Conversely, the particles in the  forward  zone of the sample diffuse into the region of 
high field gradient, such that they are accelerated more in the same direction. Consequently, 
the front zone is drawn farther so that there is a "fronting" o
  f peak. The opposite effect ­
   peak 
"tailing"  occurs if the mobility of sample area i s less than t he mobility o
  f r
  unning b
  uffer. O
  n 
neutral 
particles 
these 
conductivity 
differences 
do 
not 
affect .
 
Fig. 6: "Fronting" and "tailing" of peaks as a  result  of electrodispersion 
 
While this peaks asymmetry are always  present , it is in most cases s
  maller c
  ompared 
with other dispersion effects, such as  diffusion . On Fig. 6 are depicted a
  nions t hat a
  re highly 
distinguished  by  their  mobility.  It  is   known   that  the  "fronting"  is observed  in   fast   eluting 
11 
anions with high mobility, Gaussian peaks ­ at an  average  mobility of anions and "tailing" is 
observed in low­mobility anions which eluted last. 
If it does not interfere to peak resolution, this asymmetry can b
  e n
  eglected. H
  owever, 
it can also b
  e e
  liminated b
  y b
  ringing t he conductivity of w
  orking b
  uffer t o the c
  onductivity o
  f 
the sample. 
 
Various methods of separation 
In  capillary  electrophoresis  are manifested  various  separation mechanisms  that  are listed in 
the Table. 2 and schematically depicted in Fig. 7. 
 
Table 2: CE methods 
Methods 
Separation mechanism 
Capillary zone electrophoresis 
Zone solution mobility 
Micellar electrokinetic chromatography  Hydrophobic / ionic interaction with the micelles 
Capillary gel electrophoresis 
Size and loading 
Isoelectric focusing 
Isoelectric point 
Isotachophoresis 
“Moving connections” 
 
12 
 
Fig.  7:  A  schematic  representation  of  zone  electrophoresis,  isoelectric  focusing  and 
isotachophoresis 
 
Capillary zone electrophoresis (CZE) 
Because  of their   ease   of  use  and  versatile  applications CZE  is the most commonly 
used method which is primarily u
  sed f
  or t he separation o
  f small w
  ater­ soluble  m
  olecules. I
  t i s 
used  in  the  analysis  of  amino  acids,  peptides,  and  ions  of  various  enantiomers  (optically 
active compounds) and many other ionic compounds. CZE ­ it is t he simplest f
  orm o
  f HECE 
(High Efficiency Capillary Electrophoresis) as capillary f
  illed only w
  ith buffer. Separation o
  f 
materials into discrete zones is due to migration at different speeds. 
The  electroosmotic  flow  (EOF)   makes   possible  the  separation  of  both  cations  and 
anions.  Neutral  molecules  do  not  migrate  electrophoretically  and  move  with  EOF. 
Fundamental processes of capillary electrophoresis shown in Fig. 8. 
Since  the  electroosmotic  flow  can  be  greater  than  the  electrophoretic  mobility, the 
cations, anions and neutral particles move through the capillary with different speeds. 
13 
• Cations moved most quickly, as the electrophoresis and EOF have the same direction. 
• The neutral particles do not separate, they move only under the EOF. 
• Small anions migrate against EOF toward the anode, because t heir electrophoretic mobility 
higher than the EOF. 
•  Large  anions  slowly  migrate  towards  the  cathode  because  their  electrophoretic  mobility 
lower than the EOF. 
 
Fig. 8: ​
The principle of capillary zone electrophoresis 
 
Since the  electrophoretic  mobility  of ions depends on the pH, the selectivity in CZE 
can  be  very simply  varied  by  changing  the  pH  of  the buffer. The type of the buffer is very 
important   for  a  successful separation.  The  separation  can  be optimized by the  addition  of a 
surfactant or chiral components. 
CZE is o
  ften u
  sed in t he biology, p
  articularly f
  or the a
  nalysis of p
  eptides and proteins. 
CZE  also  finds  application  in  pharmaceutical  analysis,  the  study  of  metabolites  and 
environmental analysis. Inorganic ions and  organic  acids, which are traditionally determined 
by  ion  chromatography,  may  also  be  analyzed  CZE.  Since  ions,  in  general,  are  not 
chromophores and  even   absorb  ultraviolet  light, it  is  necessary  to operate with  indirect  UV 
detection. For  this  use  as buffer solutions are  used  solutions  of  chromate  or  imidazole  and 
detected at a buffer maximum absorption wavelength (e.g., 254 nm for chromate). 
14 
Ions  of  eluting  sample  displace  chromate  ions  and  thereby   reduce   the  absorption, 
whereby "negative" peaks appear.  Due to the high mobility of small ions EOF is not s
  trong 
enough  to  move  the  ions  in the  opposite direction  of  their  electrophoretic  movement, i.e. 
anions  move  toward  the  anode  and  respectively,  small  anions  can  not  be  analyzed 
simultaneously with other components of the sample. 
To reduce the EOF or to  change  its direction, the s
  o­called E
  OF m
  odifier i s a
  dded  to 
the working  electrolyte.  That role  plays , for example, a hydrophobic quaternary ammonium 
salt  or cationic surfactants, which due to adsorption on the silica s
  urface can modify e
  xisting 
therein charge ratio and thus modify the EOF [7.141]. The  action  of the cationic surfactants, 
adsorbed on the silica surface is shown in Fig. 9. 
In 5 millimolar (mM) solution of chromate migration used  for indirect U
  V d
  etection 
is generally presetn the  following  sequence: 
S​
О 2–​