Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine

INVERTAAS e β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas (EC 3.2.1.26) e β-fruktofuranosidaas- ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside e glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi vastavalt reaktsiooni üldskeemile:
Joonis 1. Invertaasi toime glükosiidsidemele
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide (süsivesikuid, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jäägi furanoosset vormi) hüdrolüüsireaktsiooni. Vabanevad fruktoosi molekulid:
Joonis 2. Invertaasi toime β-D-fruktofuranosiididele
SAHHAROOS – looduses levinuim β-D-fruktofuranosiid. Hürdolüüsi produktideks on β-D- fruktoos ja α-D-glükoos. Hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude pool t (oluline seedeensüüm!!!) toodetava invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile:
Joonis 3. Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel
Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi.
INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMISE MEETOD:

• Põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariiidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel
  
• Vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus
  

Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide (glükoosi ja fruktoosi) koguse kindlakstegemiseks kasutatavad meetodid:

KOMPLEKSOMEETRILINE MEETOD:

• Põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus ⟹ sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi:
  

Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mile pHopt4,8, inaktiveerivalt. Lõpetab ensüümreaktsiooni

Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise kk-a ja vask(II)-triloon B kompleksi
Kompleksi valmistamine:
.võetakse ekvimolaarsete hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumsoola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B)
.kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahus
Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov (sisaldab taandavaid suhkruid) viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuri toimel:

suhkrute toimel taandub kompleksis sisalduv Cu(II)→Cu(I). Moodustub Cu2O. Eraldub reaktsioonisegust punase sademena.

Lahusesse jääb ekvivaletsetes kogustes vaba triloon B Joonis 4. Keemistemperatuuril toimuvad muutused
Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus tehakse kindlaks tiitrimise teel:

• Kasutada tuleb 0,02 M vasksulfaadi lahust
  
• Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega
  
• Taastekib kompleks , mis on detekteeritav indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi
  

Joonis 5. Tiitrimise reaktsioonivõrrand
Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus.
INVERTAASI AKTIIVSUS:

• VEDEL ensüümpreparaat: avaldatakse mikrokatalites ensüümilahuse 1 ml kohta ()
  
• TAHKE ensüümpreparaat: avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta ().
  

NB! 1 - ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jookul 30°C juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1), st 1
taandavat suhkrut.

3.1.1. Töö käik

ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: Tabel 1. Kokkuvõtlik tabel tähtsamatest andmetest
TÖÖLAHUSE MAHT
10 ml
LAHJENDUSMÄÄR
40x lahjendus
VEDELA PREPARAADI VAJALIK MAHT
10 ml/40 = 1/4= 0,25 ml
ENSÜÜMREAKTSIOONIKS KASUTATAVA ENSÜÜMI MAHT (Invertiin)
0,5 ml

Doseerin vedelat preparaati automaatpipetiga gradueeritud katseklaasi

Lisan sobiva lahjendusmäära saamiseks vajalik kogus puhvrit.

Sulgen katseklaasi korgiga ja loksutan lahust kontsentratsioonide ühtlustamiseks
ENSÜÜMREAKTSIOONI (SAHHAROOSI HÜDROLÜÜSI) LÄBIVIIMINE:

Võtan 50 ml mahuga katseklaasi

Pipeteerin sinna 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvriga, mille pH=4,8)

Varustan katseklaasi korgiga ja asetan 5-10 minutiks vesitermostaati 30±1 °C juurde soojenema
Tabel 2. Ensüümreaktsiooni läbiviimise tähtsamad etapid

Võtan kolm 250 ml mahuga koonilist kolbi.

Pipeteerin neisse 10 ml komplekslahust.

Kui substraat on termostaadis saavutanud temberatuuri 30 °C (umbes 5-10 minuti pärast), lisan sellele 0,5 ml invertiini töölahust. Loksutan lahuse kiirelt läbi, võtan automaatpipettiga 1 ml lahust ja viin kolbi A. Käivitan stopperi. Asetan katseklaasi kiiresti tagasi termostaati.

Viin kolbidesse reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid , et määrata neis taandavate suhkrute sisaldus.
0- proov : Selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel A
B
B-proov: 10 minutit pärast ensüümreaktsiooni algust viin siia 1 ml reaktsioonisegu
C
C-proov: 20 minutit pärast ensüümreaktsiooni algust viin siia 1 ml reaktsioonisegu. Tegelikkuses viisin 45 sekundit hiljem.
REAKTSIOONIPRODUKTIDE SISALDUSE MÄÄRAMINE:
Vastavalt eespool toodud reaktsiooniskeemile redutseerub Cu(II) taandavate suhkrute toimel ja formeerub Cu2O punane sade . Samal ajal vabaneb ekvimolaarne kogus triloon B. Reaktsioon toimub keemistemperatuuril.

Asetan komplekslahust ja erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove sisaldavad kolvid elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema . NB! Aega arvestatakse keemise algusest!

10 minutit pärast lõpetatakse keetmise 150 ml dest. vee valamisega kolbi läbi püstjahuti. NB! Vett mõõda mõõtsilindriga! ⟹ suureneb ühtlasi vedeliku maht kolvis ja indikaatori värvuse muutus on tiitrimisel paremini märgatav

Võta kolb pliidilt ja jahutatakse kraanivee all toatemperatuurini.

Kõikidesse kolbidesse lisa indikaatorina 6 tilka mureksiidi vesilahust, mis annab kolvis olevale lahusele sinaka tooni.

Kolbides olevate lahuste tiitrimine viiakse läbi 0,02 M CuSO4 lahusega kuni sinakas värv asendub selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega.
Joonis 6. Kalibreerimisgraafik
AKTIIVSUSE ARVUTAMINE:
Vedela invertaasi preparaadi uurimisel avaldatakse aktiivsus ensüümpreparaadi 1 ml kohta (). Arvutus viiakse läbi vastavalt valemile:
kus
C1- taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
C2- taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
V1- reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml
103- tegur üleminekuks mikrogrammidele
L- lahjendusmäär, mida kasutatai vedelast ensüümipreparaadist töölahuse valmistamisel
T- hüdrolüüsi kestus s
180- glükoosi molekulmass
V3 - proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
Tulemused erinevad üksteisest:
62,63 – 100%
49,11 – x%
Seega tulemused erinevad üksteisest 100%-78,41% = 21,59%

Kokkuvõte

Käesoleva töö eesmärgiks oli kindlaks teha invertiini aktiivsus, kasutades selleks kompleksomeetrilist meetodit: põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning mis tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna. Sahharoosi hüdrolüüsil vabanevad invertiini toimel taandavad suhkrud glükoos ja fruktoos.
Nende summarse konsentratsiooni saab määrata reaktsioonisegust. Kuna keetmisel taandub suhkrute toimel kompleksis sisalduv Cu(II) → Cu(I)-ks, siis jääb lahusesse vaba triloon B, mistõttu lahus on sinine.
Tiitrimisel reageerib lahuses olev vaba triloon B CuSO4-ga. Kui kogu lahuses olev vaba triloon B on CuSO4-ga reageerinud , jääb lahus püsivalt rohekaks, sest moodustub kompleks Cu (II)-triloonkompleks. Värvuse muutust aitab detekteerida mureksiid.
Vaadates kalibreerimisgraafikut, võiks pidada katset õnnestunuks, kuid kui heita pilk arvutatud aktiivsustele, siis A10 ja A20 erinevat üksteisest 21,9%. Arvan peapõhjuse leidvat ikka tiitrimises: tulemus 4,12 ml ei ole number, mille eest ma pea julgeksin anda, sest just viimase tilga lisamisel keerasin ma kraani vales suunas ning lahusesse sattus tublisti rohkem CuSO4 lahust, kui oleks tohtinud. Arvestasin „sorina kestust“ ja seda, kui palju „umbes“ selle ajaga lahusesse CuSO4-a võis minna. Karmilt öeldes on arv 4,12 täitsa umbes võetud. Tegelikkuses on see valitud ikka mingeidki tõdesid silmas pidades.
Kui rääkides aktiivsustest konkreetselt, siis:

• A10 = 49, 11
  
• A20= 62,63
  
• Aarit=55,87
  

Katset oli iseenesest väga tore teha. Oma tiitrimisoskusi ei pea ma halvaks, küll aga oleksin pidanud veenduma katse alguses, kuidas kraan ikkagi täpselt töötab. Ehk oleks siis ka lõpptulemus olnud täpne.
Joonis 7. Pildid katse erinevatest etappidest
Joonis 7. Pildid katse erineva- test etappidest
Joonis 7. Pildid katse erineva- test etappidest
Joonis 7. Erinevatest katseetappidest tehtud pildid