Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Kahjuksm pole asi ikka korras.
Kindlasti ei teinud te apelsinimahla uurides 25-kordset lahjendust, vaid 250-kordse.
Tehke lõpparvutus 250-kordse lahjendusega. Ja kindlasti leidke kirjandusest \ internetist andmed, millega oma tulemust võrrelda.
08.06.15. M. Kreen
3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Protokoll on koostatud väga lohakalt. Isegi see pole selge, kas uurisite sidruni või apelsinimahla
Palun koostage protokoll oma jõududega, ärge laske end eeskujudest eksitada
22.05. M. Kreen
Liina Reimann
134537KATB
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β, D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juureolekul. GOx katalüüsib glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel. GOx on liitvalk e flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniinnukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina.
FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas.
Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide(elektronide doonorite) oksüdeerumist kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. NB Mida alltoodud reakts . skeem näitab
Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt ,siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt.
Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
Värvusetu Värviline
Mis tegelikult toimub Kirjutage õige reakts. skeem.
Lisaks nimetatud orgaanilistele ühenditele võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures.
Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi , puuviljad või muu taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös.

Töö käik

Tööreaktiiv

Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga.
25 ml tööreaktiivi koosnes:

• 2,5 mg glükoosi oksüdaasi
  
• 1,5 mg peroksüdaasi
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH=6
  
• K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitumist lõppmahuni
  

Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine

Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon, oli minu katse puhul apelsinimahl .
Apelsinimahlast tuli valmistada 250-kordne lahjendus. Selleks pipeteerisin gradueeritud katseklaasi 1 mL apelsinimahla ja ülejäänud 24 mL täitsin destilleeritud veega.
NB. Apelsinimahla puhul pole selline lahjendus reaalne, sEllest ka lõpptulemuse ebaõige suurusjärk.

Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimislahustesirge koostamiseks

Glükoosi standardlahus sisaldab 1,0 mg/mL glükoosi. Standardlahusest valmistasin 3 lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL ja 0,062 mg/mL.
Lahjendatud glükoosilahuste tegemiseks võtsin kolm puhast ja kuiva katseklaasi. Aga edasi, kuidas toimisite
Lahjendamisel toimisin järgnevalt: Pipeteerisin standardlahusest 2,5 ml. Lahjendasin selle 7,5 ml veega. Loksutasin korralikult. Sellest omakorda pipeteerisin järgmisesse katseklaasi 5ml, lisasin 5ml vett, loksutasin korralikult. Sellest omakorda taas 5 ml lahust ja lisan 5ml vett, loksutasin.
Lahjendamisel lähtusin põhimõttest, et lahjendamiseks võetud standardlahuse mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub võrdne ainehulk .
Lahjendatud lahuse mahuks oli 10 mL. Millise lahuse Lahjendatud glükoosilahustel oli lahuse kogumahuks 10 mL

Värvusreaktsiooni läbiviimine

Nummerdasin 6 puhast ja kuiva katseklaasi ja asetasin need statiivi.
Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 mL destileeritud vett. See oli kontrollproov ehk 0- proov , mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni.
Katseklaasidesse nr 2 ja nr 3 pipeteerisn 1 mL uuritavat lahust ehk apelsinimahla (2 paralleelproovi)
Katseklaasi nr 4 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL.
Katseklaasi nr 5 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,125 mg/mL ja katseklaasi nr 6 1 mL glükoosilahust, mille kontsentratsioon oli 0,062 mg/mL.
Kõigisse kuude katseklaasi pipeteerisin 3 mL tööreaktiivi ja loksutasin, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril.
Mõõtsin spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optiliste tiheduste väärtused. Võrdluslahusena kasutasin destilleeritud vett.

Tulemused

Kuna ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu (tingitud tööreaktiivi komponentidest), siis tuleb kõikide glükoosi sisaldavate lahuste(katseklaasid 2-6) optiliste tiheduse väärtusi korrigeerida , lahutades neist kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse. Korrigeeritud väärtusi kasutan ka kalibreerimisgraafiku loomisel.
Proov
Optiline tihedus
Katseklaas nr 1 (Kontrollproov/0-proov)
0,004 Mis on selle näit peale korrigeerimist  Pärast korrigeerimist loeme selle näidu 0-ks.
Katseklaas nr 2 (I paralleelproov)
0,121 - 0,004 = 0,117
Katseklaas nr 3 (II paralleelproov)
0,120 - 0,004 = 0,116
Katseklaas nr 4 (C4 = 0,25 mg/mL)
0,157 - 0,004 = 0,153
Katseklaas nr 5 (C5 = 0,125 mg/mL)
0,087 - 0,004 = 0,083
Katseklaas nr 6 (C6 = 0,062 mg/mL)
0,036 -0,004 = 0,032

Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine

Kaliibrimisgraafiku koostasin standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosikontsentratsiooniga proovide absorptisooni väärtuste alusel. Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsentratsiooni ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust.
Miks sirge ei läbi 0-punkti Parandasin graafikut , nüüd läbib
Paralleelproovide keskmine optiline tihedus:
Kaliibrimissgraafikult leidsin, et sellele optilisele tihedusele vastab glükoosi kontsentratsioon:
Cglükoos/apelsinimahl = 0,187 mg/mL (25 korda lahjendatud lahuses)
Tundmatu proovi glükoosisisaldus on seega:
Glükoosisisalduse massiprotsentides naturaalse mahla suhtes arvutasin valemiga:
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg /mL)
L – mahla lahjendustegur
d – mahla tihedus (g /cm3) d = 1,031328 g/cm3 Kust see d väärtus Ja selline täpsus antud juhul on absurdne. Vabalt võib lugeda d1,0

Järeldus

Katse tulemusena sain, et ühes 1 g apelsinimahla sisaldus 5,515  Vt ülal 4,675 mg glükoosi, mis on 4,7 %.
Kirjanduse andmeid apelsinimahla kohta kahjuks ei leidnud. Palun otsige veel, siis näete, kas teie tulemus on reaalne. Interneti andmetel varieerub apelsini glükoosisisaldus 2,2-8% vahele, mis tähendab, et minu tulemus 4,7% on küllaltki reaalne.
Vead võisid tuleneda ebatäpsest lahjendamisest ja selles, et antud apelsinimahl ei olnud värskelt pressitud, vaid seisnud mõnda aega külmkapis.
ALLIKAD:
http://www.diabetesincontrol.com/index.php?option=com_content&view=article&id=4486
http://thepaleodiet.com/fruits-and-sugars/