Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

TTÜ Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0061 Biokeemia I
Laboratoorne töö nr. 5
Töö pealkiri:
3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Õpperühm:
YAFB21
Töö teostaja:
Jana Sarnavskaja(YAFB163900)
Õppejõud:
Tiina Randla
Töö teostatud:
21.03. 2017
Protokoll esitatud:
16.04.2017
Protokoll arvestatud:
3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides on laialdaselt kasutusel ensümaatiline meetod, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul.
GOx-i süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi:O2-oksüdo-reduktaas näitab, et ta katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku (flavoproteiini), mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk (kaks subühikut). Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad .
FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
POx on samuti koostiselt liitvalk , mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (=dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.
Kasutades substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat ) saab POx-i reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
Reaktsiooni skeem on järgmine:
Peroksüdaas
Taandatud substraat + H2O2 → Oksüdeeritud substraat + 2H2O
Värvusetu Värviline
peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6] ehk kollast veresoola. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks . Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures.
Peroksüdaas
2Fe2+ + H2O2 + 2H+ → 2Fe3+ + 2H2O
Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, antud juhul sidrunis. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraati(ll).
TÖÖ KÄIK
Tööreaktiiv
Antud töös on kasutusel 25 ml-ne tööreaktiiv, mis sisaldab glükoosi oksüdaasi (GOx) (2,5 mg) ja peroksüdaasi (POx) (1,5 mg), reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit (pH=6,0) (16,6 ml) ja kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) (lisatakse kuni lõppmahuni).
Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Tööreaktiiv säilitatakse külmkapi temperatuuril.
Uuritava lahuse ettevalmistamine
Antud töös määrasin sidruni glükoosisisaldust. Selleks pressisin sidrunist natuke mahla välja. Praktikumi juhendajalt sain lahjendusmäära: 1 ml sidrunimahla 25 ml lahuses. Lisasin 25 ml-sesse mõõtekolbi 1 ml sidrunimahla (automaatpipetiga) ning täitsin kolvi sisu destilleeritud veega kriipsuni. Sain sidrunimahla 25x-se lahjenduse.
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
Glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlakstegemiseks tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik , mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel λ=410 nm. Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsent-ratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (=optilise tiheduse) väärtust nimetatud lainepikkusel.
Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard-lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistatakse kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml.
NB! Lahjendamise põhimõte: lahjendamiseks võetud lahuse (standardlahuse) mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub üks ja sama ainehulk ehk kehtib võrrand
Cst • Vst = Clahj • Vlahj
Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid.
Glükoosilahuste (lahjenduste) tegemisel lähtusin kõrvalolevast skeemist.
Selleks valmistasin glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml (2,5 ml töölahus + 7,5 ml dest. vesi), loksutasin. Seejärel lahjendasin seda glükoosilahust 2 korda (5 ml esimene lahus + 5 ml dest. vesi), loksutasin. Saadud teist lahjendust lahjendasin veel 2 korda (5 ml teine lahus + 5 ml dest. vesi), loksutasin.
Värvusreaktsiooni läbiviimine
Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks on vaja 6 puhast, kuiva ja nummerdatud katseklaasi.

• Katseklaasi nr 1 pipeteeritakse 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov).
  
• Katseklaasidesse nr 2 ja 3 pipeteeritakse 1 ml uuritavat lahust (2 paralleelproovi).
  
• Katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 pipeteeritakse igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust, mis valmistati ülalkirjeldatud viisil.
  

• Igasse katseklaasi pipeteeritakse 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse kohe, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Tööreaktiivil tuleb enne kasutamist lasta soojeneda külmiku temperatuurilt toatemperatuurini
  
• Fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg ja katseklaase hoitakse 20 minutit toatemperatuuril. Aeg peab olema piisav, et jõuaksid toimuda reaktsioonid, mille tulemusena glükoosi sisaldavad lahused värvuvad tekkiva kaaliumheksatsüanoferraat(III) toimel kollaseks.
  
• Lainepikkusel 410 nm mõõdetakse lahuste optilise tiheduse väärtused. Võrdluslahusena kasutatakse destilleeritud vett.
  

NB! Kuna ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu , siis tuleb kõikide glükoosi sisaldavate lahuste (katseklaasid 2–6) optilise tiheduse väärtusi korrigeerida, lahutades neist kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse. Korrigeeritud väärtusi kasutatakse ka kaliibrimisgraafiku koostamisel.
Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Kaliibrimisgraafik koostatakse standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovide (katseklaasid 4, 5, 6) absorbtsiooni (optilise tiheduse) väärtuste alusel. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust (A). Korrigeeritud absorptsiooni väärtusi kasutamisel ja eksperimendi korrektsel läbiviimisel (täpselt tehtud lahjendused) kujutab graafik endast koordinaatide alguspunkti läbivat sirget.
Katseklaas
Optiline tihedus
( lainepikkus λ=410 nm)
Optiline tihedus – kontrollproovi optiline tihedus
1. dest. vesi (kontrollproov)
0.0401
0
2. sidrunimahl ( proov 1)
0,1359
0,0958
3. sidrunimahl (proov 2)
0,1251
0,085
4. 4x lahjendus
(0,25 mg/ml)
0,1670
0,1269
5. 8x lahjendus
(0,125 mg/ml)
0,1038
0,0637
6. 16x lahjendus
(0,062 mg/ml)
0,0724
0,0323
Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses leitakse kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide (katseklaasid 2 ja 3) keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi. Kuna mina lahjendasin sidrunimahla enne värvusreaktsiooni läbiviimist, siis graafikult leitud glükoosi kontsentratsioon lahjendatud sidrunimahlas tuleb korrutada lahjendusteguriga.
Paralleelproovide (katseklaasid 2 ja 3) keskmine optiline tihedus
(0,1359 + 0,1251) / 2 = 0,1305
Et saada täpne glükoosi kontsentratsioon, leian sirge võrrandi, mis väljendab kaliibrimisgraafikut.
Sirge võrrand kahe punkti abil:
Leian sirge võrrandi:
y = 0,5x + 0,0013
Asendan paralleelproovide arvutatud keskmise optilise tiheduse sirge võrrandisse
0,1305 = 0,5x + 0,0013 → x = 0,2584 (mg/ml)
Tundmatuks prooviks oli sidrunimahl seega tema glükoosisisaldus avaldatakse massiprotsentides (X, %) naturaalse mahla suhtes järgmise valemiga:
X = C • L • 10-3 • d • 100
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (0,2584 mg /ml),
L – mahla lahjendustegur (25)
d – mahla tihedus (2,584 g/cm3)
Glükoosisisaldus massiprotsentides:
X = 0,2584 • 25 • 10-3 • 2,584 • 100 = 1,67 %
Järeldused
Allikaist leidsin, et sidrun sisaldab umbes 0,8 – 1,9% glükoosi. Toetudes sellele võin väita, et katse sai läbiviidud korrektselt, seda tõendab ka kaliibrimisgraafik, mis tuli sirgjooneline. 100g sidrunis on umbes 1,67% glükoosi.