KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE LIPIIDIDE REAKTSIOONID (1)

TTÜ Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Töö nr. 2.2 ja 1.3
KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE
MÄÄRAMINE
LIPIIDIDE REAKTSIOONID
2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
Karotenoidid on ühendite rühm, mis klassifitseeritakse kui tetraterpenoidid. Struktuurilt on nad polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid. Karotenoidid jagunevad ksantofüllideks ja karoteenideks ehk hapnikku sisaldavad ja hapnikku mittesisaldavateks.
Karotenoidide ülesanded on:

• Valgust absorbeerida ja edasi kanda klorofüllile.
  
• Kaitsev roll, neelates liigset valgusenergiat ning kaitstesrakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
  
• Vitamiin A eelühend, mille funktsiooniks on nägemisprotsessi tagamine. Lisaks sellele vitamiin A tõkestadab loomorganismides lipiidide oksüdatsiooni ning kaitseb silmi kahjuliku sinise ja UV-kiirguse eest.
  
• Tagada rakkudevaheline suhtlus.
  

Tähtsaim karoteeni isomeer on β- karoteen , mis esineb punakas-oranžide kristallidena, mis sulavad temperatuuril 183–184 ºC. β-karoteen ei lahustu vees ja vesilahustes, ka polaarses lahustis on lahustuvus küllaltki piiratud, kuid apolaarsetes orgaanilistes lahustites lahustub β-karoteen hästi. Puhtal β-karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 425, 450 ja 480 nm juures.
Karotenoidid on kõik värvilised, värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel, seda intensiivsem on tema punane värvus. Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas tuleneb nende molekuli ehitusest. Molekul koosneb pikast , konjugeeritud kaksiksidemeid sisaldavast süsivesinikahelast. Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi. Viimane kujutab endast absorptsiooni ehk optilise tiheduse sõltuvust uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest λ.
Neeldumisspekteri neeldumismaksimumid võivad paikneda erinevatel lainepikkustel, kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide.
Mõned näited karotenoididest:
Töö käik:
Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist
Kaalusin 0,6g tomatit. Viisin kaalutise uhmrisse, lisasin selle pestud liiva ning alustasin peenestamist. Ühtlasele massile lisasin väikesete portsjonite kaupa NaHSO4 , et tomatis olev vesi siduda. Jätkasin massi hõõrumist uhmri nuiaga. NaHSO4 lisasin kuni on moodustunud kuiv pulbriline mass.
Alustatasin ekstraktsiooni, lisades uhmris olevale peenestatud massile väikeste koguste
kaupa heptaani. Materjali segasin jätkuvalt uhmri nuiaga, sademel lasin põhja settida ja selle kohal olev ekstrakt kantsin teelusika abil filtrile ning alustasin ekstrakti kogumist mõõtsilindrisse. Seda operatsiooni kordasin kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvusetuks. Lõpuks määrasin ekstrakti kogumahu.
Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs
Neeldumisspekterit mõõtsin nähtava valguse lainepikkustel 350-650 nm. Nullisin heptaaniga ning mõõtsin oma ekstrakti neeldumisspektrit. Spektrofotomeetri ekraanile tuli neeldumisspekter, kursori nihutamisega leidsin ekstrakti neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad optilise tiheduse täpsed väärtused.
Tulemused:
Ekstrakti kogumaht : 15 ml
Heptaani tihedus 0,684g/cm3
Kolm neeldumismaksimumi:

λ=503,5 nm 0, 3710 A E1%=3150

λ=473,0 nm 0,4749 A E1%=3450

λ=447,0 nm 0,3497 A E1%=2250
Tomatis ei ole karotenoidide segu, ainus karotenoid on lükopeen, mille neeldumismaksimumid on 506 nm, 473 nm ja 446 nm.
Karotenoidi sisaldus uuritavas proovis:
Järeldus:
Saadud lükopeeni sisaldus 2,35 mg%.
Kirjanduses leiduvate tulemusega, mis on 0,88mg-4,2mg lükopeeni 100g tomatis.
http://en.wikipedia.org/wiki/Lycopene
1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, enamasti esineb neis estersidemeid. Lipiidid sisaldavad hüdrofoobseid aatomirühmi ja pikki süsivesinikradikaale ja seetõttu lipiidid ei lahustu vees ega vesilahustes, vaid apolaarsetes orgaanilites solventides ja veidi ka polaarsetes solventides.
Lipiidide funktsioon:

• organismides rakumembraanide koostiskomponendiks
  
• energeetiliseks varuaineks.
  
• kaitse funktsioon
  
• nad on signaalmolekulideks ning mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus.
  

Lipiide võib klassifitseerida mitmeti.
Üldlevinud on järgmine rühmitamine: rasvhapped, rasvad , glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid , vahad, steroidid , terpenoididrasvhapped, rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad, steroidid, terpenoidid.
Lisaks liigitatakse: seebistuvateks ja mitteseebistuvateks. Molekuli struktuuri järgi võib lipiide jaotada liht-, liit- ning tsüklilisteks lipiidideks . Lihtlipiidid on rasvad ja vahad, liitlipiidide rühma kuuluvad fosfo- ja glükolipiidid, tsükliliste lipiididena tuntakse tsükliliste alkoholide baasil moodustuvaid lipiide.
Rasvad e. triatsüülglütseroolid on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Hüdrofoobsed rasvamolekulid sobivad toiduenergia säilitamiseks.
Glütserofosfolipiidid on peamiseks koostisosaks rakumembraanides. Lisaks kahele rasvhappe radikaalile sisaldavad nad fosforhappe jääki ja seetõttu on nad amfipaatsed ja tänu sellele saavad need lipiidid moodustada vesikeskkonnas struktuure, nagu membraanid, vesiikulid või liposoomid.
Steroolide ehk steroidalkoholide ehituslikuks aluseks on steraanituum. Steroolid on võimelised moodustama rasvhapetega estreid, mida tuntakse steriidide nime all. Levinuim on kolesterool , mida leidub loomsete rakumembraanide koostises ja mis tagab membraanide läbitavuse ja liikuvuse. Lisaks sellele toodetakse kolesteroolist sapphappeid, steroidhormoone ning D-vitamiini. Sama funktsiooni taimerakkudes täidab fütosterool.
1.3.1 Rasvapleki proov
Lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel jääb paberile rasvaplekk . Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam .
Töökäik:
Uurisin kahte tahket proovi. Võtsin kummastkist väikse koguse proovi ning panin nad eraldi kuiva katseklaasi. Mõlemasse katseklaasi lisasin 0,5 ml atsetooni . Loksutasin ja lasin proovil settida. Mõlemast katseklaasist võtsin pipetiga tilk lahust filterpaberile ja lasin kuivada. Kuiva paberit vaatasin vastu valgust ning varju suunas.
Järeldus:
Suurem plekk tekkis teise proovi materjalist kui esimesest . See tähendab, et teine proov sisaldas rohkem lipiide kui esimene.
1.3.2. Emulsioonitest
Emusioonideks nimetatakse selliseid süsteeme, millised koosnevad kahest teineteises mitteahustuvast vedelikust, üks nendest on jaotatud teises väikesteks tilkadeks. Üks vedelik peab olema polaarne ja teine mittepolaarne . Tavaliselt on üheks vedelikuks vesi ja teiseks on vähepolaarne orgaaniline vedelik. Rasvade iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes, aga nad lahustuvad orgaanilistes solventides. Kui taolises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt segada või loksutada , siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .
Töökäik:
Kahte kuiva katseklaasi valasin 1 ml kahte erinevat uuritavat lahust. Katseklaase loksutatasin kuni homogeense lahuse moodustumiseni. Seejärel lisasin mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutasin taas.
Järeldus:
Hägu tekkis esimeses katseklaasis, teises katseklaasis oli lahus selge. See tähendab, et lipiide sisaldab esimene proov.
1.3.3 Akroleiiniproov
Glütserooli kuumutamisel tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal ehk akroleiin . Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfolipiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid. Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, kas tegemist on
glütserooli sisaldava või mittesisaldava lipiidiga.
Töökäik:
Kahte katseklaasi panin ~1g NaHSO4 ja lisasin mõni tilk kahest erinevast uuritavast materjalist. Katseklaase kuumutasin tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulamise ja proovi tumenemiseni. Nuusutasin katseklaasidest eralduvat lõhna.
Järeldus:
Mõlemast katseklaasist tuli ebameeldivat lõhna, aga esimene oli veidi magusam, sarnanes toiduõli kõrbemislõhnaga. Teisest katseklaasist tuli kummipõlemise haisu, mis tähendab, et tegemist ei ole loodusliku ainega ning ei sisalda glütserooli. Glütserooli sisaldas esimene proov.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga on iseloomulik pruun värvus, küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töökäik:
Kolme kuiva katseklaasi valasin 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis: palimithape, või ja päevalill. Kõigisse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval võrdne kogus broomi lahust kloroformis, loksutasin.
Järeldus:
Palmithappe lahus värvus tume oranziks, või lahus muutus hele kollaseks ning päevalille õli lahus jäi värvusetuks. Küllastunud rasvhapet sisaldab palmithape ning veidi ka või. Päevalill sisaldab küllastamata rasvhappeid.
1.3.5 Liebermann-Burchard'i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas-rohelise värvusega reaktsioonisegu. See on mitmeastmeline reaktsioon ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi.
Töökäik:
Kolme kuiva katseklaasi valasin 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis-kolesteroolilahust, või ja päevalille lahust. Igasse katseklaasi lisasin värsket äädikhappe anhüdriidi ja kontsentreeritud väävelhapet ning loksutasin hoolikalt.
Järeldus:
Kuna reaktiive läks lahustesse palju, siis see võis põhjustada ebatäpseid tulemusi. Kolesteroolilahus oli algul sinine, seistes muutus aga lahus tume roheliseks. Või lahus oli algul veidi kollakas , seistes muutus lahus õrnalt sinakas-roheliseks. Päevalilleõli lahus oli tumedam kui või lahus. Tulemuste põhjal saab järeldada, et steroole sisaldavad kõik lahused , aga kõige vähem kolesterooli sisaldus on võis. Päevalilleõli sisaldab fütosterooli ning kolesterool kolesterooli.