Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine (0)

Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö nr.2.2, 1.3
Anna Logunova YAGB-22
Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Teooria
Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides, aga ka mõningates teistes fotosünteesivates organismides (vetikates, mõnedes seentes ja bakterites ) sisalduvad
fotosünteesi abipigmentidena karotenoidid . Viimased absorbeerivad valgust klorofüllist
mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ja on seega täiendavateks kiirguse retseptoriteks.
Karotenoidid on väga arvukas (> 600) ühendite rühm, milliseid keemilise ehituse poolest
klassifitseeritakse kui tetraterpenoide (sisaldavad 40 süsiniku aatomit). Struktuurilt on nad polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid.Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen, milline on ka tähtsaks vaheühendiks paljude teiste karotenoidide sünteesis.
Karotenoidide on kaks põhigruppi :
• karoteenid – hapnikku mittesisaldavad molekulid, koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust; esindajateks on karoteeni α -, β -, γ-, δ-, ζ- jt isomeerid, samuti lükopeen,
• ksantofüllid – hapnikku sisaldavad molekulid; esindajateks luteiin , zeaksantiin jt.
Karotenoidide ülesanned:

• Valguse absorbeerimine ja klorofüllide edastamine .
  
• Kaitsev roll: neelavad liigsed valgusenergiat, kaitsevad rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
  

Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A provitamiiniks (eelühendiks). Enamus toiduga seedekulglasse sattunud karotenoididest allub soole mikrofloora poolt produtseeritava ensüümi karoteeni oksügenaasi toimele ja neist moodustub vitamiin A.
Karoteeni α-, β- ja γ-isomeeridest omab suurimat tähtsust β- karoteen (punakasoranž), mille molekul loomorganismis poolestub, andes 2 retinooli ehk vitamiin A1 molekuli.
β-karoteen on kristalliline aine sulamistemperatuuriga 183-184 oC, mis vees ei lahustu. Etanoolis lahustub karoteen piiratus ulatuses, kuid lahustub hästi apolaarsetes orgaanilistes lahustites . Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma.
Hulgaliste konjugeeritud kaksiksidemete tõttu neelab β-karoteen valgust spektri nähtavas osas. Seetõttu saab karoteeni sisaldust uuritavas materjalis objektiivselt iseloomustada neeldumisspektri järgi. Puhtal karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 450 ja 480 nm juures.
Töö eesmärgiks oli taimsetest materjalidest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine ja β-karoteeni sisalduse määramine uuritavas proovis.
Töö käik
Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist:

• Uuritav proov oli petersell ,mida võeti 0,04 g.
  
• Proovi peenestamine toimus uhmris . Selleks panin väljakaalutud proov kaaluklaasist ilma kadudeta uhmrisse ning lisasin väike kogus pestud liiva ja hõõrutasin nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni.
  
• Seejärel kisasin segusse veevaba Na2SO4, et taimses materjalis sisalduvat vett siduda,jätkates samal ajal massi hõõrumist.
  
• Massi hõõrumine lõpeb, kui on moodustunud kuiv, pulbriline mass.
  
• Edasi toimus karotenoidide ekstraktsioon (=väljalahustamine) proovist sobiva orgaanilise lahustiga ( Petrooleeter ) ja ekstrakti filtrimine.
  
• Filrimiseks võtsin 25ml mõõtsilinder, lehter ja filterpaber.
  
• Seejärel alustasin ekstraktsiooni,selleks lisasin uhmris olevate peenestatud massile väikeste koguste(5-10ml) kaupa ekstrahenti.
  
• Materjali segasin uhmri nuiaga, sademel lastakse põhja settida ja selle kohal olev ekstrakt kantsin teelusika abil filtrile. Seda operatriooni korratasin kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks.
  
• Lõpuks määrasin kindlaks ekstrakti kogumaht . (V=9 ml)
  

Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs:

• Spekter mõõtsin lainepikkuste vahemikus 350-650 nm,kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (Petrooleeter).
  
• Spektrofotomeetri ekraanile joonistus uuritava lahuse neeldumisspekter , millel kursori nihutamisega näitasin ära need lainepikkused, kus paiknesis iseloomulikud neeldumismaksimumid ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused.
  

Lainepikkus
Optiline tihedus
421,5 nm
0,0852 A
448,5 nm
0,1036 A
474,0 nm
0,0890 A
α-karoteen
λmax 1
λmax 2
λmax 3
E% 1cm
Heksaan
475
445
420
2735
Kuna neeldumismaksimumid on üsna sarnased, saame teha järelduse, et tegemist on karotenoidide seguga , kus domineerib α-karoteen.
Karotenoidi sisalduse arvutamine:
A – absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile
λmax (kõrgeimale „tipule“ vastav A väärtus), A=0,1036
Ε1cm1%– vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse
absorptsioon ) sama λmax juures, Ε1cm1%=2735
V – ekstrakti kogumaht, ml, V=9ml
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3, d=0,65g/cm3
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g, g=0,04g
103 – tegur milligrammidele üleminekuks.
Järeldus: Antud töö eesmärgiks oli peterselli karotenoidse sisalduse määramine: α- karoteeni sisaldus petersellis on 5,53 mg%, 100g 100g ekstraktis on 5,53 mg α-karoteeni.
Lipiidide reaktsioonid
Teooria
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersideme(te) esinemine. Reeglina ei lahustu lipiidid vees ja vesilahustes, vaid apolaarsetes orgaanilites solventides, nagu triklorometaan (kloroform), tetraklorometaan (tetrakloorsüsinik), benseen , eeter, jt. Vähemal määral lahustuvad nad polaarsetes solventides, nagu metanool, etanool jt. Lipiidide lahustumatus vees ja vesilahustes on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis.
Lipiidide funktsioonid:

• Rakumembraanide põhiline koostiskomponent kõikides organismides.
  
• Loomsetes organismides, aga ka mitmetes taimsetes kudedes peamine energeetiline varuaine.
  
• kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid: nad on signaalmolekulideks ning mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus.
  

Lipiide võib vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele klassifitseerida mitmeti. Üldlevinud on järgmine rühmitamine:

• rasvhapped,
  
• rasvad ,
  
• glütserofosfolipiidid,
  
• sfingolipiidid ,
  
• vahad,
  
• steroidid ,
  
• terpenoidid.
  

Lähtudes seebistumisvõimest võib lipiide jaotada:

• seebistuvateks (rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad),
  
• mitteseebistuvateks (steroolid, prostaglandiinid ja terpenoidid).
  

Vastavalt molekuli struktuurile võib lipiidid jaotada ka veel: liht-, liit- ning tsüklilisteks lipiidideks . Lihtlipiidid on ( neutraal )rasvad ja vahad, liitlipiidide rühma kuuluvad fosfo- ja glükolipiidid, tsükliliste lipiididena tuntakse tsükliliste alkoholide baasil moodustuvaid lipiide,nagu näiteks kolesteriidid.
1.3.1. Rasvapleki proov
Teooria
Kõigi lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valget vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam.
Töö käik
Kahte katseklaasi pandi 1g kummastki tahke aine proovist. Mõlemasse katseklaasi valati umbes 1 ml orgaanilist lahustit (atsetooni). Loksutati ja lasti 5 min sesita. Mõlemast katseklaasist kanti pipetiga tilk tahke materjalikohal olevat lahust paberile ja kuivatati.
Tulemus
Esimene katseklaas : Akroleiin proov nr.1
Teine katseklaas : Akroleiin proov nr.2
Proovi nr 2 sisaldava lahuse plekk paistis vastu valgust heledam ja vastu varju tumedam. Proovi nr 1 sisaldava lahuse pleki kohalt muutusi läbipaistvuse osas polnud. Seega sisaldas 2. proov lipiide.
1.3.2. Emulsioonitest
Teooria
Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks
(dispergeerunud faas) on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus (pidevas faasis). Kuna emulsioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.
Rasvade kui rasvhapete glütserüülestrite iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus ja
lahustumatus vees ja vesilahustes. Küll aga lahustuvad nad orgaanilistes solventides, nagu kloroform, benseen, aga ka atsetoon , metanool jt. Kui taolises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt segada või loksutada , siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon . Emulsioonid on üldlevinud toiduainete valdkonnas (piim on õli-vees tüüp, või on vesi-õlis tüüp), värvitööstuses (lateksvärvid) ja paljudel muudel elualadel. Reeglina on neil juhtudel tegu rohkem kui kahekomponentsete süsteemidega, mis emulsiooni stabiilsuse eesmärgil sisaldavad ka stabiliseerivaid lisandeid.
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi valasin 2 ml 96%-list etanooli ja lisasin 2 ml kahte erinevat
uuritavat lahust, millest üks sisaldab lipiidi, teine mitte. Katseklaase loksutasin kuni
homogeense lahuse moodustumiseni. Seejärel lisasin mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutasin taas intensiivselt.Vaatasi, kumba proovi sisaldavas katseklaasis muutub segu häguseks .
Tulemus
Katseklaasis nr.2 lahus muutus häguseks,seega see lahus sisaldas lipiide.
Katseklaasis nr.1 lahus ei muutunud,seega see lahus ei sisaldunud lipiide.
Vastupidi peaks olema. Lipiide sisaldab see lahus, mis muutus häguseks. Parandage järeldused ära.
1.3.3. Akroleiiniproov
Teooria
Glütserooli kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal (akroleiin). Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfatiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid.
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi panin 1g NaHSO4 ja lisasin ~0,5g akroleiini proovi nr 1 ja 2. Kuumutasin põletil tõmbekapis soola sulamise ja reaktsioonisegu tumenemiseni. Eralduvat lõhna nuusutasin ettevaatlikult.
Tulemus
Katseklaasis teise prooviga sool hakkas sulama esimesena ja värvus muutus tumesiniseks,see tõestas seda,et teine proov sisaldas lipiidi,mille koostisesse kuulub glütserool.
1.3.4. Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Teooria
Küllastumata rasvhapete sisaldumise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus lahjeneb, küllastumata rasvhapete puhul aga muutub lahus toimuva liitumisreaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis: või,oliiviõli,steariinhape. Kõigisse katsklaasi lisasin tilkhaaval 10 tilka broomi lahust metüleenkloriidis ning vaatasin toimunud muutusi.
Tulemus
Steariinhappe lahus oli ühtlaselt kollkaspruun,seega steariinhape on küllastunud rasvhape.Teistes katseklaasides,kus olid või ja oliiviõli lahused olid kollased ,seega ei sisalda need lahused küllastunud rasvhappeid. Mis rasvade lahuseid te kasutasite? Vaadake internetist, kui palju või ja oliiviõli küllastumata rasvhappeid sisaldavad. Tehke vastavalt sellele parandused järeldustes. VVõi sisaldab 82,5% rasva,kus on 29 g küllastumata rasvhappeid.Oliiviõli sisaldab 98% rasva,kus on 11g küllastumata rasvhappeid.Seega nad ei sisalda küllastunud rasvhappeid.
1.3.5. Liebermann-Burchard’i kolesterooli määramise test
Teooria
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on
mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja
sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud arvukalt (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli
molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõppkokkuvõttes tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. Samas aga positsioonis C17 paiknev süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin 2 ml vastava lipiidi lahust metüleenkloriidis – kollesteroolilahus, rapsiõli ning või triglütseriid. Igasse katseklaasi lisasin 12 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ning 4 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning segasin hoolikalt. Vaatasin toimuvaid muutusi.
Tulemus
Kollesterooli lahus muutus tumedaks, sinakas-rohekaks – sisaldab kollesterooli.Või lahus ja rapsiõli lahus ei muutunud,seega need lahused ei sisalda kollesterooli.