Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine (0)

Laboratoorne töö № 2.2 ja 1.3
Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
Lipiidide reaktsioonid
Vladlena Šipoša 120659
YAGB21
Õppejõud: Malle Kreen, Priit Eek
Töö teostatud: 25. 03. 2013
Töö esitatud: 15. 05. 2013
2.2. KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE
Karotenoidid on arvukas (> 600) ühendite rühm, milliseid klassifitseeritakse kui tetraterpenoide, kuna neil 40 süsiniku aatomit. Struktuurilt on nad polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid.
Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen, milline on ka tähtsaks vaheühendiks paljude teiste karotenoidide sünteesis.Karotenoidide kaks põhigruppi on
• karoteenid – hapnikku mittesisaldavad molekulid, koosnevad ainult süsinikust ja
vesinikust; esindajateks on karoteeni α -, β -, γ-, δ-, ζ- jt isomeerid, samuti lükopeen,
• ksantofüllid – hapnikku sisaldavad molekulid; esindajateks luteiin , zeaksantiin jt.
Karotenoidid on abipigmentidena fotosünteesis, kuna nad adsorbeerivad valgust parem, kui klorofüll, kuna nad adsorbeerivad valgust erinevatel lainepikkusel.
Taimedes on neil aga teine ülesanne – kaitsmine, kuna nad neelavad liigset valgusenergiat ja seega kaitsevad rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.
Loomsetele organismidele on neli karotenoidi, α-, β- ja γ- karoteen ning β-krüptoksantiin,
Vitamiin A eelühenditeks (provitamiin) β-karoteenist tekib kaks, α- ja γ- karoteenist ning β-krüptoksantiinist üks retinaali molekul. Karotenoidide konverteerumine retinaaliks toimub soole mikrofloora poolt produktseeritava ensüümi (karoteeni oksügenaasi) toimel. Vitamiin A-aktiivsust omavad lisaks retinaalile ka retinool, retineenhape ja retinooli estrid .
Kuna loomsed organismid ise karotenoide ei sünteesi, siis tuleb neid omastada taimse toiduga. Karotenoidide imendumiseks peavad nad vabanema taimerakkudest ning konjugeeruma sapphapetega.
Kõik karotinoidid on värvilised. Nende värvus varieerub kollasest üle oranži tume punaseni. Mida rohkem karotenoid neelab valgust, seda intensiivsem tema punane värvus. Karotenoidid on võimelised adsorbeerida valguskiirgust spektri nähtavas osas (~400...~700nm) tänu oma polüeense struktuurile.
Kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib neeldumisspekter oluliseltmuutuda ja neeldumismaksimumid võivad paikneda nimetatuist erinevatel lainepikkustel. Kui proovis sisaldub samal ajal ka klorofüll, siis on täheldatavad neeldumismaksimumid lainepikkuste ~470 ja ~630 nm juures.
Käesoleva laboratoorse töö eesmägiks on karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest , saadud karotenoidide (ja klorofülli) segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel:
• uuritava materjali karotenoidse koostise analüüsimine ja iseloomustamine ,
• uuritavas objektis domineeriva karotenoidi, β-karoteeni või mõne teise, kontsentratsiooni kindlaksmääramine,
• klorofülli olemasolu kindlakstegemine.
Töö käik
1. Karotinoidide eraldamine taimsetest materjalidest
Eelpeenestatud paprikat kaalusin tehnilistel kaaludel 0,75 g proov. Selle lõplik peenestamine järgneb uhmris . Selleks kasutasin pestud liiva. Hõõrusin uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni, ning lisasin veevaba Na2SO4, et taimses materjalis sisaldavat vett siduda, ja jätkasin massi hõõruma kuni kuiva, pulbrilise massi moodustumiseni.
Saadud massile lisasin uhmrisse väikese koguse (10ml) orgaanilist lahustit st. heptaani selleks, et karotinoide ekstraheerida ning kasutades kuiva filtripaberit hakkasin seda filtrida. Lisasin uhmrisse ekstrahenti kuni sademe kohal olev ekstrakt muutus värvituks.
Pärast karotinoidide ekstraheerimist määrasin ekstrakti kogumaht ning sain, et see on võrdne 28,5 cm3, ning hakkasin neeldumisspektri võtma.
2. Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs
Neeldumisspektri määramiseks sobivad sellised spektrofotomeetrid, mis võimaldavad valitud spektriosas lainepikkust sujuvalt muuta. Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350–650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast heptaani.
Kuna neeldumisspekter mõõdetakse nähtava valguse lainepikkustel, siis on vaja töötada kvartsküvettidega. Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega naitasin ära ja märgitasin protokollivihikusse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud
neeldumismaksimumid (λmax) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Seejärel trükkisin neeldumisspekter välja ja jätkasin spektri analüüsimist.
Töötulemus
Spektri analüüsimisel märkasin neeldumismaksimumi asukohti (lainepikkusi). Sain 2 neeldumismaksimumi ja 1 platood : 1). 505,5 nm optilise tihedusel 0,2341 A, 2). 472,5 nm, 0,4257A, 3), 451,5 nm, 0,3939 A. Ning võrdlesin antud tabeliga ja sain, et tegemis on kapsantiiniga.
Kapsantiini iseloomulikud neeldusmaksimumid on 504 nm, 475 nm ja 462nm.
Karotenoidi sisalduse arvutamine ( kvantitatiivne analüüs)
K= A ⋅ V ⋅ d ⋅ 103 /Ε1%1cm ⋅ g (mg%) = (0,4257A ⋅ 28,5cm3 ⋅ 0, 68 g/cm3 ⋅1000)/( 1905 ⋅ 0,75) = 5,78mg%
A – adsorbtsiooni väärtus . Võtsin aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektril kõige kõrgemale „tipule“. Arvutus põhineb nimetatud lainepikkusele (λmax) vastava A väärtuse
E1%1cm – vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon ) sama λmax juures
V – ekstrakti kogumaht, ml,
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3,
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g,
103 – tegur milligrammidele üleminekuks.
Järeldus
5,78 mg% näitab, et 100g punast paprikat sisaldab 5,78 mg kapsantiini. Sõltuvalt sordist ja kasvamiseks kasutatud jäetistest paprika võib sisaldada 5.0-40,6 mg kapsantiini 100 g-s kuiva massi. Kuna tulemus asub selles vahemikus, pean oma katset õnnestunuks.
1.3 Lipiidide reaktsioonid
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersideme(te) esinemine. Tavaliselt ei lahustu lipiidid vees ja vesilahustis, ainult apolaarsetes orgaanilistes lahusti, nt alkaanid , benseen , eeter , kloroform jne. Vähesel kogusel lahustuvad polaarsetes solventides nagu etanool , metanool jt.
Selline omastus tingitud lipiidide hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikade süsinikahelate sisaldusest molekulis. Lipiidid on kõikides organismides rakumembraanide põhiliseks koostiskomponendiks, loomsetes organismides, aga ka mitmetes taimsetes kudedes peamiseksenergeetiliseks varuaineks. Lisaks sellele on neil ka kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid, nad on signaalmolekulideks ning mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus.
Lipiide võib vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele klassifitseerida mitmeti. Üldlevinud on järgmine rühmitamine:
• rasvhapped ,
• rasvad ,
• glütserofosfolipiidid,
• sfingolipiidid ,
• vahad,
• steroidid ,
• terpenoidid.
Lähtudes seebistumisvõimest võib lipiide jaotada:
• seebistuvateks ( rasvad , glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad),
• mitteseebistuvateks (steroolid, prostaglandiinid ja terpenoidid).
Vastavalt molekuli struktuurile võib lipiidid jaotada ka veel liht-, liit- ning tsüklilisteks lipiidideks . Lihtlipiidid on ( neutraal )rasvad ja vahad, liitlipiidide rühma kuuluvad fosfo- ja glükolipiidid, tsükliliste lipiididena tuntakse tsükliliste alkoholide baasil moodustuvaid lipiide, nagu näiteks kolesteriidid.
1.3.1 Rasvapleki proov
Kõikide lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites . Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam . Oluline on meeles pidada, et järeldusi saab teha kuiva(tatud) proovidega paberit uurides, sest niiske paberi läbipaistvus on suurenenud ka lipiide mittesisaldavate lahuste korral.
Töö käik
Võtsin kaks katseklaasi selleks, et uurida antud proove, kas on tegu lipiididega või mitte. Ühesse panin 1g proovi nr 1, teise – 1g proovi nr.2 ja mõlemasse lisasin 0,5 g atsetooni . Loksutasin hoolikalt ning jätsin umbes 5 minutit seista, et tahke materjal settiks. Kui sademe kohal tekkis selge lahuse kiht, kantsin mõlemast katseklaasist pipetiga tilk lahust filterpaberile ja lastsin kuivada. Kuiva paberit vaatasin vastu valgust ja märkasin, et paberil 1. prooviga on rasvaplekk, mis suurendab tema läbipaistvust.
Saan järjeldada, et lipiide sisaldas 1. proov
1.3.2 Emulsioonitest
Emulsiooniks nimetatakse kahest mittesegunevatest vedelikust koosnevat süsteemi. Kuna emulsioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.
Rasvade kui rasvhapete glütserüülestrite iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes. Küll aga lahustuvad nad orgaanilistes solventides, nagu kloroform, benseen, aga ka atsetoon , metanool jt. Kui taolises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt segada või loksutada , siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon .
Töö käik
Võtsin kaks katseklaasi, valasin mõlemasse 2ml 96%-list etanooli ning ühele lisasin I uuritav lahus, teisele II uuritav lahus ja loksutasin kuni homogeense lahuse moodustumiseni. Seejärel lisasin mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutasin veel kord. Jälgisin, mille uuritava lahusega proov sai häguseks ning märkasin, et proov II uuritava lahusega sai häguseks. Seega saab teha järeldust, et II proov sisaldas lipiide.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll veidi lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
CH3(CH2)nCH=CH(CH2)mCOOH +Br2 --> CH3(CH2)nCHBr-CHBr(CH2)mCOOH
Töö käik
Kolme katseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis: searasv , palmithape, oliivõli. Kõigisse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval võrdne kogus (kuni 10 tilka) broomi lahust kloroformis e triklorometaanis, loksutasin hoolikalt ning jälgisin toimuvaid muudatusi. Märkasin, et katseklaasid searasva ja oliivõliga said värvituks aga palmithapega jäi punase-oranžiks.
Sellest saab järeldada, et searasvas ja oliivõlis on küllastamata rasvhapped, aga palmitõlis – küllastatud.
1.3.5 Liebermann-Burchard'i kolesterooli määramise test
Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas -rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud arvukalt (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Ning kokkuvõtteks tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust: searasv, kolestrerool ja rapsõli. Igasse katseklaasi lisatakse 6...7 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4...5 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning loksutasin hoolikalt. Jälgisin katseklaasides toimuvaid värvuse muutusi ning reaktsioonisegu lõpliku värvuse kujunemist.
Märkasin, et lahus kolesterooliga sai tumeroheliseks, rapsõliga – kollase-roheliseks ja searasva lahus sai heleroheliseks. Sellest saab teha järeldust, et searasv peaegu ei sisalda kolesterooli, rapsõli aga sisaldab fütosterooli, mis on sarnaste omadustega ja annab iseloomulikku reaktsiooni.