Protokoll: Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Protokoll
Karin Roosiväli
093441KATB41
Juhendaja : Tiina Randla
2011

Invertaasi aktiivsuse määramine

Teooria

Invertaas ehk β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk β-fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib süsivesikute, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis, hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule.
Invertaas
β-D- fruktofuranosiid + H2O → β, D- fruktoos + mono- või oligosahhariid
Looduses on kõige levinumaks β-D-fruktofuranosiidiks sahharoos . Sahharoosi hüdrolüüsi produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi toodavad pärmid, hallitusseened, paljud taimed, mesilased . Inimese jaoks on invertaas oluline peensoole limaskesta rakkude poolt toodetav seedeensüüm, sest selle toimel hüdrolüüsub organismis sahharoos.
Sahharoosi kasutatakse ka invertaasi aktiivsuse määramisel, mis põhineb sahharoosi hüdrolüüsil vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks.
Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov . Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade.
Keetmisel toimub järgnev reaktisoon:
Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust. Lahusesse lisatakse ka indikaatorina mureksiidi, mis muudab värvi triloon B ja Cu(II)-ioonide kompleksi taastekkimisel.
Tiitrimisel toimub järgnev reaktsioon :
Suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrmiseks kulunud CuSO4 hulga järgi kaliibrimissirgelt. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites: vedela ensüümipreparaadi korral μkat/ml, tahke preparaadi puhul μkat/g.
Töö käik:

Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine:
Tuleb valmistada vajalik kogus sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Mõõdan pipetiga 0,5 ml vedelat ensüümpreparaati ning viin selle gradueeritud katseklaasi. Lisan 9,5 ml atsetaatpuhvrit.

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine
Pipeteerisin 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 ( substraat ). Sulgesin katseklaasi parafilmiga ning asteasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema.
Pipeteerisin kolme 250 ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust.
Kui substraat oli saavutanud termostaadis temperatuuri 30°C, lisasin sinna 0,5 ml invertaasi töölahust, loksutasin ning võtsin sellest reaktsioonisegust 1 ml lahust ja viisin ühte komplekslahusega kolbi (0-proov). Seejärel asetasin katseklaasi tagasi termostaati.
10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin reaktsioonisegust 1 ml lahust ning viisin teise komplekslahusega kolbi.
20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ning viisin selle kolmandasse kolbi.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Asetasin komplekslahuse ja reaktsioonisegust võetud proovidega kolvid elektripliidle püstjahutite alla 10 minutiks keema . 10 minuti pärast valasin kolbidesse läbi püstjahuti 150 ml destilleeritud vett. Teises ja kolmandas kolvis tekkis keetmisel lahusesse punane Cu2O sade. Võtsin kolvi pliidilt ning jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.
Lisasin kõikidesse kolbidesse indikaatorina 8 tilka mureksiidi vesilahust, mis andis kolvis olevale helesinisele tumedama sinise värvuse (kolmandas kolvis violetse).
Tiitrisin lahuseid pidevalt loksutades 0,02M CuSO4 lahusega roheka värvuse tekkimiseni.
Tiitrimistulemused:

V(CuSO4)= 1,1 ml

V(CuSO4)= 11,9 ml

V(CuSO4)= 16,5 ml
Kaliibrimisgraafikult vaadatud taandavate suhkrute sisaldus:

C=1,0 mg/ml

C=10,5 mg/ml

C=14,6 mg/ml
Arvutatud aktiivsused:
kus:
C₁ - taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
C₂ - taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
V₁- reaktaioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml
V₂ - ensüümi töölahuse üldmaht, ml
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s
180 – glükoosi molekulmass
V₃ - proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V₄ - ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
L – lahjendusmäär
A₁₀ ja A₂₀ peaksid teineteisest erinema maksimaalselt 20% võrra, kuid minu tulemuste erinevus on suurem. Katseviga võis tekkida invertaasi lahuse valmistamise käigus ning lahuste täpsete koguste pipeteerimisel. Samuti võib põhjus olla tiitrimises - arvatavasti märkasin lahuse roheliseks värvumist liiga hilja , seega olid lahused üle tiitritud.