Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Töö nr 3.1
Invertaasi aktiivsuse määramine
Koostas:
Juhendaja : Mart Reimund
Teoreetilised alused
Invertaas (β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk EC 3.2.1.26) kuulub glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule.
Looduses on kõige levinumaks β-D-fruktofuranosiidiks sahharoos . Inimesele on see oluline seedeensüüm, invertaasi toimel hüdrolüüsib sahharoos.
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi (mittetaandav) hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi (taandavad) summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit.
Lühidalt, oma sõnadega kirjutada, millel baseerub antud katses kompleksomeetriline meetod.
Põhireaktiiviks on aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi, mis toimib invertaasile inaktiveerivalt (see lõpetab ensüümireaktsiooni) ning tagab ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku aluselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi.
Hiljem ( keetmisel ) taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks (suhkrute toimel), Cu2O eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille koguse saab määrata tiitrimise teel vasksulfaadi lahusega, kui vabanenud triloon B komplekseerub uuesti vasega (on märgatav mureksiidi värvuse muutuse tõttu).
Töö käik
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Töölahuse valmistasin juhendaja näpunäidete järgi, ensüümi võtsin kaaluti 14,7 mg ning lahustina kasutasin 5ml atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,6. Tahke invertaasi preparaadi puhul jääb sobiv ensüümi kontsentratsioon lahuses 1 ja 5 mg/ml vahemikku, antud katses oli ensüümi kontsentratsioon 2,94 mg/ml.
Ensüümipreparaadi kaalumine toimus analüütilisel kaalul, lisasin vajaliku puhvri koguse ning segasin klaasi sisu 5 minuti vältel ettevaatlikult, kuni moodustus ühtlane suspensioon .
Ensüümireaktsiooni läbiviimine

• 50 ml katseklaasi pipeteerida 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris), katseklaas varustada korgiga, asetada 5-10 minutiks vesitermostaati 30◦C juurde soojenema.
  
• Kolme koonilisse kolbi pipeteerida 10 ml komplekslahust.
  
• Kui substraat on termostaadis saavutanud vajaliku temperatuuri (30◦C), lisada sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutada ning asetada tagasi termostaati. Fikseerida ensüümireaktsiooni aeg!
  
• Kohe pärast läbiloksutamist võtta reaktsioonisegust kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viia ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See on 0- proov ning proovi võtmine peab toimuma võimalikult kiiresti.
  
• 10 minutit pärast ensüümireaktsiooni algust võtta sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viia 2. kolbi.
  
• 20 minutit pärast ensüümireaktsiooni algust võtta sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viia 3. kolbi.
  

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

• Kolvid asetada elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema . Aega arvestada keemise algusest!
  
• 10 minuti pärast lõpetada keetmine , valades 150 ml destilleeritud vett läbi püstjahuti kolbi. Kolb võtta pliidilt ja jahutada kraanivee all toatemperatuurini.
  
• Indikaatoriks lisada igasse kolbi 6 tilka mureksiidi vesilahust (annab lahusele violetse tooni).
  
• Tiitrida lahused 0,02 M CuSO4 lahusega, kuni violetne värvus asendub roheka värvusega. Tiitrimise käigus kolvi sisu pidevalt loksutada!
  

Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis.
Kui palju kulus 0,02M vasksulfaadi lahust 0, 10 minuti ja 20 minuti proovide tiitrimiseks?
Tiitrisin 0,02 M vasksulfaadi lahusega kõiki kolme lahust ning tulemused on järgnevad:
0 min proov - 3,0 ml
10 min proov- 14,9 ml
20 min proov – 25,0 ml
Invertaasi aktiivuse leidmiseks kasutasin valemit:
A= (C2-C1) * V1 * V2 * 103 /( T * 180 * V3 * V4 * g )
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml (13,2 ja 22 mg/ml)
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml (2,7 mg/ml)
V1 – reaktsioonisegu üldmaht, ml (26ml)
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, ml (5ml)
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s (600s ja 1200s)
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml (1ml)
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml (1ml)
G – ensüümipreparaadi kaalutis, g (0,0147g)
A10= (13,2 -2,7) * 26 * 5 * 103 /( 600 * 180 * 1 * 1 * 0,0147) = 859,8 µkat/g
A20=(22-2,7) * 26 * 5 * 103 /( 1200 * 180 * 1 * 1 * 0,0147) = 790,2 µkat/g
A =( A10 + A20) / 2 = (859,8 + 790,2)/2= 825,0 µkat/g
Mida näitab/väljendab invertaasi aktiivsus 825 µkat/g?
1 katal on selline ensüümi hulk, mis konverteerib 1 sekundi jooksul ensüümile optimaalsetel tingimustel 1 mooli substraati reaktsiooniproduktideks.
Kuna see on aga väga suur ühik, siis praktikas kasutataksegi tihti ühikuna hoopis µkatalit.
Defineerisid ühiku 1 katal. Antud töös leiti, et invertaasi preparaadi aktiivsus on 825 µkat/g. Mida väljendab konkreetselt 825 µkat/g? St kui palju taandavaid suhkurid tekib, mis aja jooksul, mis preparaadi koguse kohta?
825 µkat/g väljendab seda, et taandavaid suhkruid tekib 825 mikromooli 1 sekundi jooksul 1 g preparaadi kohta.
Järeldus
Ideaalis peaksid tulemused kokku langema või erinema teineteisest maksimaalselt 20 % võrra. Kuna ka minu tulemused on võrdlemisi sarnased ja erinevus on väiksem kui 20%, siis loen invertaasi aktiivsuse määramise katse õnnestunuks.