Valkude ja süsivesikute reaktsioonid (0)

1.1 VALKUDE KVALITATIIVSED REAKTSIOONID;
1.2 SÜSIVESIKUTE KVALITATIIVSED REAKTSIOONID
Ave Tüür
155356
YAGB21
Juhendaja :

Valkude reaktsioonid

Valgud on polüpeptiidid, milles olevad aminohapped on omavahel seotud peptiidsidemete abil. Peptiidside moodustub ühe aminohappe karboksüülrühma reageerimisel teise aminohappe aminorühmaga. Valkude koostises leidub 20 üldlevinud aminohapet, mida nimetatakse proteogeenseteks aminohapeteks. Lisaks neile sisaldavad mõningad valgud ka nn ebaharilikke aminohappeid .
Valgud, nagu teisedki biopolümeerid, täidavad oma funktsioone tänu iseloomulikele ruumilistele struktuuridele, mis tulenevad primaarsest struktuurist, st aminohapete valikust ja järjestusest polüpeptiidahelas. Ahela lokaalset korrapärastumist iseloomustab sekundaarne struktuur, kogu valgumolekuli kolmemõõtmelise struktuuri iseloomustamiseks kasutatakse tertsiaarse struktuuri mõistet. Valgumolekulide ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega.
Valgu unikaalse ruumilise struktuuri lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Selle käigus grupeeruvad ümber või katkevad nõrgad sidemed, kuid peptiidsidemed. Valgu denatureerumine võib vähendada tema lahustuvust, mis omakorda põhjustab valgu väljasadenemise lahusest. Valgu peptiidsidemete lagunemist nimetatakse valgu hüdrolüüsiks.
Valkude kindlakstegemiseks kasutatakse mitmeid meetodeid nagu:

• värvusreaktsioonid peptiidsidemete või teatavate aminohapete tuvastamiseks,
  

• väljasadestamine lahusest reagentide või temperatuuri toimel denaturatsiooniprotsessi uurimiseks või valkude eraldamiseks madalama molekulmassiga peptiididest,
  

• väljasoolastamine lahusest erinevate valgufraktsioonide lahutamiseks.
  

Töö etapid

1.1.1 Biureedireaktsioon
Valkude üldreaktsioon, mis on tingitud peptiidsidemete esinemisest. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu+2 ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse biureetkompleksi.
Töö käik: Katseklaasi valada 1 ml munavalgu lahust. Lisada 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust.
Tulemus: Esialgu oli reaktsioonisegu värvus sinine, seejärel muutus lillaks. Reaktsioon tõestas peptiidsidemete olemasolu munavalgu lahuses.
Tekkinud biureetkompleksi struktuur:
1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon )
Reaktsioon tõestab aromaatse tuuma sisaldavate aminohapete(trüptofaan; türosiin; fenüülanaliin) olemasolu valgus. Lämmastikhappe lisamisel valk denatureerub. Katseklaasi sisu soojendades toimub aromaatsete tuumade nitreerumine (kollase värvusega), omandab leelisesises keskkonnas oranzi värvuse.
Töö käik:1 ml munavalgu lahusele lisada 6 tilka kontsentreeritud HNO3 . Loksutada , soojendada , kuni sade on kollane. Jahutada. Lisada NH4OH lahust kuni ilmub ammoniaagi lõhn.
Tulemus: Valge sade muutus soojendades kollaseks. NH4OH lisades muutus sade oranzikaks. Katse tõestas, et munavalk sisaldab aromaatset tuuma sisaldavaid aminohappeid.
1.1.3 Milloni reaktsioon
Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid(türosiini radikaalid). Valgu lahus või sade värvub soojendamisel roosakaks või punaseks.
1. katseklaas
2. katseklaas
Töö käik: Võetakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse 6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendatakse.
Tulemus: Esialgu tekkis valge sade, mis soojendamisel muutus punakaks.
Reaktsioon andis positiivse tulemuse, ehk munavalgus on türosiini.
Töö käik: Võetakse 1 ml želatiini lahust ja lisatakse 6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendatakse.
Tulemus: Reaktsioonisegu oli peale soojendamist kollakas. Katse tulemus oli negatiivne- želatiin ei sisalda türosiini.
Munavalgu lahuses türosiini reageerimisel Milloni reaktiiviga tekkinud struktuur:
1.1.4 Sulfhüdrüüli- e. Tioolireaktsioon
Reaktsioon näitab tsüsteiini esinemist valgus. Tsüsteiini radikaalis sisalduv -SH rühm allub leeliselisele hüdrolüüsile, andes sulfiidioone, mis Pb+2-ioonide olemasolul annavad musta või tumepruuni sademe.
Töö käik: Võetakse 2ml Pb( CH3COO )2 0,5% lahust ja lisatakse 10%-list NaOH lahust(Pliietanaat moodustab aluselises keskkonnas naatriumplumbaadi). Seejärel lisatakse 1 ml munavalgu lahust. Reaktsioonisegu soojendatakse, kuni moodustub sade ja pannakse statiivi.
Tulemus: Katseklaasis tekkis pruunikas sade. Seega sisaldab munavalk tsüsteiini.
1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape on valke denatureeriv reagent , kuid ei sadesta peptiide, mille molekulmass on alla 10 000. Seda saab kasutada valkude eraldamiseks madalamolekulaarsetest lämmastikuühenditest, nagu valgu hüdrolüüsi produktid .
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse mõned tilgad CCl3COOH lahust.
Tulemus: Katseklaasi tekkis valge sade, valk denatureeris. Seega on munavalgu molekulmass üle 10 000.
1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Väljasoolastamine- neutraalsete soolade kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni, millega kaasneb väljasadestumine. Globuliinid sadestuvad poolküllastunud lahuses, albumiinid aga küllastunud lahuses.
Töö käik: 2 ml munavalgu lahusele lisatakse 2 ml (NH4) 2SO4 küllastunud lahust. Tekkinud sade eraldatakse filtrimise teel ning filtraadile lisatakse kristalset (NH4)2SO4 kuni saavutatakse küllastuskontsentratsioon.
Tulemus: Lisades munavalgu lahusele (NH4)2SO4 lahust, moodustub globuliinide sade. Peale filtreerimist ja kristalse ühendi lisamist on aga tegu poolküllastunud lahusega, seega seal sadestuvad albumiinid. Filtreerimata lahuses oli rohkem globuliine, filtreeritud lahuses aga albumiine.
1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Enamasti kaasneb valkude denatureerumisega ka valkude välja sadestamine. Kui aga keskkonna pH väärtus erineb valgu isoelektrilise täpi väärtusest väga palju siis ei pruugi valk lahusest välja sadestuda.
1. katseklaas
2. katseklaas
Töö käik: 2 ml munavalgu lahusele lisatakse 1 ml etaanhapet . Kuumutada.
Tulemus: Peale kuumutamist on katseklaasis segu selge, puudub sade. See on tingitud sellest, et etaanhappe pH erineb valgu isoelektrilise täpi väärtusest. Kõik valgumolekulid omandasid ühesuguse („+” või „-”) laengu ning valk-valk interaktsioonid lakkasid.
Töö käik: 2ml munavalku kuumutatakse.
Tulemus: Katseklaasi on tekkinud valge sade. Valk oli denatureerunud ning välja sadestunud.
1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Valk sadestub lahusest välja ning võib pöörduvalt denatureeruda. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada.
Töö käik: 2 ml munavalgu lahusele lisatakse tilgakaupa ja segu loksutades orgaanilist solventi, kuni tekib sade. Seejärel lahjendada katseklaasi sisu veega.
Tulemus: Orgaanilise solvendi lisades tekkis sade, kuid veega lahjendades see ei lahustunud. Toimus pöördumatu denaturatsioon. See võis olla tingitud orgaanilise solvendi lisamises liiga suures koguses.

Süsivesikute reaktsioonid

Süsivesikud on arvukas bioloogiliste ühendite rühm, mis koosnevad ainult süsinikust, vesinikust ja hapnikust. Vastavalt struktuurile jaotatakse neid mono - , oligo - ja polüsahhariidideks. Lisaks sellele, et monosahhariidid ehk monoosid täidavad organismides olulist energeetilist rolli ja kuuluvad koensüümide ning nukleiinhapete koostisse, on nad ka oligo- ja polüsahhariidide „ehituskivideks“. Monosahhariidide molekulid erinevad stereostruktuurilt ja seetõttu võivad nende omadused oluliselt erineda. Tänu aldehüüd- või ketorühma esinemisele omavad kõik monoosid redutseerimisvõimet. Oligosahhariidide molekulid koosnevad mõnest (2–10) monosahhariidi molekuli jäägist( sahharoos , laktoos, maltoos jt), polüsahhariidides ehk polüoosides on aga sajad või tuhanded lihtsuhkru molekulid ühinenud pikkadeks sirgeteks või hargnenud struktuuriga ahelateks (tärklis, glükogeen jt).
Oligosahhariidid jaotatakse redutseerivateks ja mitteredutseerivateks. Polüsahhariidide molekulides on vaba poolatsetaalse hüdroksüülrühma osatähtsus marginaalne, sest see esineb vaid iga polüsahhariidi ahela ühes otsas.
Enamus süsivesikute kvalitatiivseks määramiseks kasutatavaid reaktsioone baseerub karbonüülrühma esinemisele molekulis. Reaktsioonitingimustest sõltuvalt oksüdeeruvad suhkrud seejuures erinevateks produktideks . Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud metallide ioone (Ag+, Cu2+, Fe3+) ning teisi oksüdeerijaid. Neutraalses või happelises keskkonnas toimub suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita ja produktideks on mitmesugused happed .
Teine osa analüüsi meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali
(pentoosidest) või 5-hüdroksümetüülfurfuraali (heksoosidest) moodustumisele süsivesikute
kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul. Mõlemad aldehüüdid moodustavad
kondenseerumisel fenoolidega (α-naftool, resortsinool jt) värvilisi ühendeid.

Töö etapid

1.2.1 Molisch’i test
Süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitest, kuna positiivse tulemuse annavad nii mono-, oligo- kui polüsahhariidid. Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad, moodustades furfuraale.. Tekkinud kihid reageerivad edasi α-naftooliga ja moodustavad lillaka kihi lahuse ja happe piirile.
1.katseklaas
2.katseklaas
Töö käik: Katseklaasi valatakse 2 ml sahharoosi ja lisatakse 6 tilka Molisch’i reaktiivi. Loksutada! Ettevaatlikult lisatakse 1 ml väävelhapet. Edaspidi ei tohi katseklaasi loksutada.
Tulemus: Erinevate kihtide vahele moodustus lillakas kiht.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 2 ml glükoosi ning lisatakse 6 tilka Molisch’i reaktiivi. Loksutada. Seejärel lisatakse 1 ml väävelhaper ning katseklaasi ei loksutata!
Tulemus: Erinevate kihtide vahele moodustus lillakas kiht.
Mõlemad suhkrud andsid positiivse tulemuse. Suhkrud dehüdreerusid. Dehüdreerumist põhjustab heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali või 5-hüdroksümetüülfurfuraali moodustumine süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul. Mõlemad aldehüüdid moodustavad kondenseerumisel fenoolidega (α-naftool) värvilisi ühendeid
Reaktsioon glükoosi näitel:
1.2.2 Osasoonide saamine
Osasoonid tekivad taandava suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Need kristalluvad lahusest hästi välja.
1.katseklaas
2.katseklaas
Töö käik: 2 ml arabinoosile lisatakse 0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati. Segu hoitakse 40 minutit keevas veevannis, seejärel jahutatakse jäävannis. Tekkinud kristallidest moodustatakse preparaat ning vaadatakse mikroskoobis kristallide kuju.
Töö käik: 2 ml laktoosile lisatakse 0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati. Segu hoitakse 40 minutit keevas veevannis, seejärel jahutatakse jäävannis. Tekkinud kristallidest moodustatakse preparaat ning vaadatakse mikroskoobis kristallide kuju.
Tulemus: Tekkisid küll õrnad kristallid, kuid mikroskoobi all neid näha ei olnud võimalik.
Näiteid osasoonide kristallidest:
glükoos
1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon
Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest(Tolleni reagent) sadestub metalliline hõbe taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli.
Töö käik: Katseklaasi valatakse 1 ml 1%-list AgNO3 lahust, lisatakse 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust. Seejärel lisatakse 1 ml glükoosi lahust. Loksutatakse hoolikalt ning soojendatakse veevannis.
Tulemus: Katse ebaõnnestus. Klaasi tekkis hall hägu. See oli arvatavasti tingitud katseklaasi mustusest. Õnnestunud katse korral oleks taandunud hõbe sadestanud klaasi seintele peeglina ning näinud välja järgmine:
1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
Fehlingi I ja II lahuse kokkusegamisel saadakse leeliseline vask(II)tartaatkompleks. Seda kasutatakse taandavate suhkrute määramisel.
Struktuur
Tekkiv kompleks reageerib aldooside või ketoosidega järgmiselt:
Vaba aldehüüd- või ketorühma toimel vask taandub, andes vask(I)oksiidi, mis punase sademena lahusest välja sadestub. Suhkur ise aga oksüdeerub reaktsiooni käigus vastavaks happeks . Positiivse tulemuse annavad ainult taandavad suhkrud.
1.katseklaas
2.katseklaas
Töö käik: 1 ml sahharoosi lahusele lisatakse 1 tilk kontsentreeritud soolhapet. Hoitakse 5 minutit veevennis. Seejärel lisatakse 1 ml Fehlingi I ja 1 ml Fehlingi II lahust.
Tulemus: Peale Fehlingi reaktiivi lisamist omandas reaktsioonisegu sinise värvuse. Peale teist soojendamist tekkis katseklaasi punane Cu2O sade.
Töö käik: Katseklaasi pannakse 1ml sahharoosi lahust. Hoitakse 5 minutit veevennis. Seejärel lisatakse 1 ml Fehlingi I ja 1 ml Fehlingi II lahust.
Tulemus: Peale Fehlingi reaktiivi lisamist omandas reaktsioonisegu sinise värvuse. Peale teist soojendamist värvus ei muutunud.
Tulemus on tingitud sellest, et positiivse reaktsiooni annavad vaid taandavad suhkrud, seega sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga reageerivad selle hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos . Soolhappe lisamine 1. katseklaasis kiirendas hüdrolüüsi ning tekkisid glükoos ja fruktoos, mis on taandavad suhkrud.
1.2.5 Barfoed’ reaktsioon
Barfoed’ reaktiiv – Cu(CH3COO)2 lahus äädikhappes.
Reaktsioon võimaldab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske vaid monosahhariidid. Positiivse reaktsiooni korral tekib punane Cu2O sade.
1. katseklaas
2.katseklaas
Töö käik: 1 ml fruktoosile(monosahhariid) lisatakse 3 ml Barfoed’ reaktiivi, segatakse ja hoitakse kuumal veevannil maksimaalselt 5 minutit.
Tulemus: Kuumutades tekkis paari minuti jooksul punane sade. See tõestas, et tegu on monosahhariidiga.
Töö käik: 1 ml laktoosile(oligosahhariid) lisatakse 3 ml Barfoed’ reaktiivi, segatakse ja hoitakse kuumal veevannil maksimaalselt 5 minutit.
Tulemus: Sadet ei tekkinud, kuna tegu oli oligosahhariidiga.
1.2.6 Selivanoff ’i reaktsioon
Suhkrute kuumutamisel tugevate mineraalainete juuresolekul moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfuraal, heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal.
Tekkivad ühendid annavad mitmealuseliste fenoolidega reageerides värvilisi produkte. Üks selleks kasutatavaid reaktiive on Selivanoff’i reaktiiv, mis sisaldab HCl, resortsinooli ja FeCl3. Reaktsiooni produkti värvus varieerub punakaspruunist tumepruunini. Reaktsioon toimub ketoosidega kiiremini kui aldoosidega.
1.katseklaas
2.katseklaas
Töö käik: 1 ml fruktoosi lahusele lisatakse 2 ml Selivanoff’i reaktiivi, loksutatakse ja soojendatakse 5 minutit keeval veevannil.
Tulemus: Kuumutades muutub reaktsioonisegu värv punakaks. See tõestab, et tegu on ketoosiga, kuna reaktsioon toimus kiiremini.
Töö käik: 1 ml glükoosi lahusele lisatakse 2 ml Selivanoff’i reaktiivi, loksutatakse ja soojendatakse 5 minutit keeval veevannil.
Tulemus: Reaktsioonisegu värv kuumutamisel eriliselt ei muutunud. Pikemat aega kuumutades hakkas segule tekkima roosakas toon. Tegu on järelikult aldoosiga.
1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklisel on omadus moodustada joodiga lillakas-siniseid komplekse, kuna polüsahhariidide ahelad keerduvad joodi molekulide ümber. Tekkinud kompleks laguneb kõrgel temperatuuril ja kaotab värvuse.
Töö käik: katseklaasi valatakse 4-5 ml tärkliselahust ja lisatakse 1 tilk joodilahust. Segu kuumutatakse keemiseni. Seejärel katseklaasi alumine pool jahutatakse jäävannil. Tekkinud materjalist valmistatakse preparaat ning vaadeldakse mikroskoobi all erinevaid tärkliseterade kujusid .
Tulemus: Reaktsioonis tekkis sinine sade. Selle värvuse tõttu on tärkliseterade mikroskoobi all vaatlemine palju lihtsam.
Mõned näited nähtud teradest: