Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Töö number 3.1
Invertaasi aktiivsuse määramine
Versioon 1
Töö teostaja :
Karina Gailit
YAGB
134365
Töö juhendaja :
Malle Kreen
Tallinn 2014
Invertaasi aktiivsuse määramine
Teooria
Invertaas (β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas, EC 3.2.1.26) on ensüüm,mis kuulub glükosiidsidemete hüdrolaaside hulka. Sellised ensüümid katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi vastavlt skeemile:
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:
Sahharoosi hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos.
Invertaasi preparaatide määramisel ka kasutatakse substraadina sahharoosi.
Hüdrolüüsi käigus tekkinud glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemise meetodiks on kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi.
Kompleksi valmistatakse Na2CO3 lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja triloon B(ETDA-Na).
Reaktiivi roll:

• Toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümreaktsiooni
  
• Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-trioloon B kompleksi.
  

Kindlal ajahetkel reaktsioonist võetud proovi(sisaldab taandavaid suhkruid) viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandaub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(i)-ks. Moodustub Cu2O ja eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B. Keetmisel
toimuv reaktsioon :
Kasutades 0,02 M vasksulfaadi lahust määratakse vabanenud triloon B koguse tiitrimise teel.Selle käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel toimuv reaktsioon:
Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi ja kaliibrimissirget kasutades leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse tahke preparaadi puhul mikrokatalites 1g kohta μkat/g.
Töö käik
Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine
Lahustina kasutasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Tahke invertaasi preparaadi puhul jääb sobiv ensüümi kontsentratsioon lahuses 1 ja 5 mg/ml vahemikku.
Tahke invertaasi oli vaja võtta 2mg/mL, töölahuse ruumala on 5 mL. Kaalusin analüütilistel kaaludel 10 mg invertaasi. Panin invertaasi katseklaasi, lisasin 5 mL puhvri kogus. Segasin sisu 5 min klaaspulgaga kuni tekkis ühtlane suspensioon . Selget lahust ei tekkinud, sest ensüümpreparaat on tehniline ja sisaldab muid valke ja tähtaineid.
Ensüümreaktsiooni(sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

• Võtsin 50 mL-st katseklaasi ja pipiteerisin 25 mL 7%-list sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8(see on substraat ). Panin korgi katseklaasile ja asetasin 10 minutiks vesitermostaati 30oC juurde soojenema.
  
• Võtsin kolm 250mL-st kolbi ja pipeteerisin igaühe sisse 10 mL komplekslahust.
  

Põhimõtteks on viia reaktsioonisegust kindlatel aegadel võetud proovid , et neis määrata taandavate suhrute sisaldust.
Pärast 6 min soojendamist. kui substraat saavutas 30oC lisasin sellele 1 mL invertaasi töölahust, loksutasin seda. Kiiresti pärast loksutamist võtsin kuiva pipetiga 1 mL sellist lahust ja viisin seda esimese kolbi sisse, kus on kompleks lahus.Samal ajal käivitasin stopperit, et fikseerida ensüümreaktsiooni algust. See on 0- proov , kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel .
Pärast panin reaktsioonisegu tagasi termostaati.
10 min pärast võtsin veel 1 mL lahust sama pipetiga ja viisin seda teise komplekslahust sisaldavasse kolbi.
20 min pärast peale ensüümreaktsiooni algust võtsin viimast kotrda 1 mL reaktsioonilahust ja viisin seda kolmase kolbi sisse.
Eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine.
Vastavalt eelpooltoodud reaktsiooniskeemile redutseerub Cu(II) taandavate suhkrute toimel ja formeerub Cu2o punane sade. Samal ajal vabaneb ekvimolaarne kogus triloon B. Reaktsioon toimub keemistemperatuuril.
Kolvid , mis sisaldavad komplekslahust ja erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, asetasin elektripliidile püstijahutite alla 10 min keema . Aega arvestasin keemise algusest.
Mõõtsin mõõttsilindriga 150 mL vett ja 10 min pärast lõpetasin keemist vee valamisega läbi püstjahuti.Seda on vaja teha selleks, et suureneda ühtlasi vedeliku maht kolvis ja indikaatori värvuse muutus on tiitrimisel paremeni märgatav.Jahutasin kolbi kranivee all toatemperatuurini.
Lisasin kõikidesse kolbidesse 0,3 mL mureksiidi vesilahust, mis andis kolvis olenevale lahusele violetse tooni.
Tiitrisn kolbides olevate lahused läbi 0,02M CuSO4 lahuse kuni violetne värvus asendus selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Loksutasin tiitrimise käigus kolvi sisu pidevalt. Fikseerisin neid väärtusi, millised kutsusid välja esimest värvuse muutust. Panin kirja titrandi maht, mis kulus rohelise värvuse saavutamiseks.
Leidsin tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi kaliibrimisgraafiku taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 mL-s reaktsiooni võetud proovis.
Tiitrimise tulemused:
proov kulunud CuSO4 maht, ml Glyc mg/ml
0 2,2 2,0
1 6,7 6,0
2 12,5 11,0
Invertaasi preparaadi aktiivsus(A) μkat/g arvutatakse valemi järgi:
Kus:
C1-taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, 2,0 mg/mL
C2-taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T(10 min või 20 min pärast ensüümreaktsiooni algust) võetud proovis, 6,0 mg/mL ja 11,0 mg/mL
V1-reaktsioonisegu üldmaht, mL- 26 mL
V2- ensüümi töölahuse üldmaht, 5 mL
103-tegur üleminekuks mikrogrammidele
T-hüdrolüüsi kestus, 600 s ja 1200 s
180-glükooosi molekulmass,
V3-proovi maht taandavate suhkrute määaramiseks, 1 mL
V4-ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, 1 mL
G-ensüümipreparaadi kaalutis, 0,01 g
Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena.Selleks arvutasin katseandmete alusel ensüümi aktiivsus A10 kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsiooni 10. minutit(T=10 min=600 s) võetud proovis ja A20, kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsiooni 20.minutil(T=20min=1200 s) võetud proovis.
Tulemused erinevad teineteisest vähem, kui 20% võrra. Erinevus on 12%. Töö on läbi viidud korrektselt.
Akesk= =511,585 μkat/g
6