Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

3.1. Invertaasi aktiivsuse määramine
Invertaas , süstemaatilise nimetusega β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas (EC 3.2.1.26) on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidenete hüdrolüüsi.
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:
Sahharoos on looduses kõige levinum β-D-fruktoduranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on β-D- fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed, aga ka mesilased .
Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi.
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus.
Sahharoosi hüdrolüüsi küigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Nimetatud kompleks valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleemdiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B).
Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub komplesis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena.
Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja komleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Töö käik:
Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine
Uuritavast tahke ensüümi preparaadist valmistan lahus, mille kontsentratsioon võrdub 5 mg/ml.
Analüütilistel kaaludel kaalun 25 mg ensüümi. Minu kaalutis on 0,0258 g.
Viin kadudeta ensüümi gradueeritud katseklaasi ja lisan 5 ml atsetaatpuhvrit pH väärtusefa 4,8.
Segan klaaspulgaga u 5 min kuni ensüüm on lahustunud.
Ensüümreaktsiooni läbiviimine
Võtan 50 ml mahuga katseklaas , kuhu pipeteerin 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaaspuhvris (pH = 4,8).
Katseklaas varustan korgiga ja asetan 10 minutiks vesitermostaati 30±1°C juurde soojenema.
Võtan kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerin 10 ml komplekslahust. Nummerdan neid.
Kui substraat on soojenenud, lisan sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust. Lahust loksutan läbi ja fikseerin ensüümireaktsiooni alguse aeg.
Võtan kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viin esimesse kolbi, kus on komplekslahus (0-proov).
Kohe asetan katseklaas termostaati tagasi.
10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtan sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viin teise kolbi.
20 minutit peale ensüümreaktsiooni algust võtan veel 1 ml reaktsioonisegu ja viin kolmandasse kolbi.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Kolvid asetan elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema . Aega arvestan keemise algusest.
10 minuti pärast valan kolbidesse läbi püstjahuti 150 ml destilleeritud vett.
Kolvid võtan pliidist ja jahutan toatemperatuurini.
Esimeses kolvis oli sinine värvus, teises kolvis juba helesinine, aga kolmandas sinist tooni üldse ei olnud, lahus oli helepunane. Kõik kolvid oli punase Cu2O sademega .
Kõikidesse kolbidesse lisan indikaatorina 0,3 ml mureksiidi vesilahust, mis annab kolvis olevate lahusele violetse tooni.
Kolbides olevate lahuste tiitrimine viin läbi 0,02 M CuSO4 lahusena kuni violetne värvus asendub püsiva roheka värvusega.
Tiitrimiseks kuulunud CuSO4 lahuse maht:

3,35 ml

31,45 ml

48,00 ml
CuSO4 lahuse mahu järgi leian kaliibrimigraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1ml-s reaktsioonisegust võetud proovis:

3,0 mg/ml

27,8 mg/ml

42,4 mg/ml
Invertaasi preparaadi aktiivsus (A) μkat/g arvutan valemi järgi:
kus:
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml;
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml;
V1 – reaktsioonisegu üldmaht, ml;
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, ml;
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml;
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml;
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele;
T – hüdrolüüsi kestus, s;
g – ensüümipreparaadi kaalutis, g.
Aritmeetiline keskmine:
Invertaasi preparaadi aktiivsus: 1079,95 (μkat/g)
Arvutan, kuidas erinevad teineteisest A10 ja A20:
Järeldus:
Minu katse tulemused näitasid, et ensüümi aktiivsus oli suur. Kolmandas kolvis, kus oli segu pärast 20-minutilist reaktsiooni, tekkis punane värvus, st tekkis rohkem Cu2O. A10 ja A20 erinevad teineteisest natuke rohkem, kui 20%. Ma arvan, et viga katses võis tekkida automaatpipetiga ebakorrektse mahu mõõtmise tõttu.