Laboratoorne töö (1)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL3312 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
3. Biokatalüüs
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Tallinn 2010
3.BIOKATALÜÜS
3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
TEOREETILISED ALUSED
Invertaas ehk sahharaas on ensüüm , mis katalüüsib β, D – fruktofuranoosiide hüdrolüüsi:
β, D – fruktofuranoosiide + H2O → alkohol + fruktoos
Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos . Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, aga ka paljud taimed. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisele uuuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisele reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel:
Glükoosi ja fruktoosi koguse kinladktegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiiv – tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II) – triloon B kompleksi. Leeliseline komplekslahus toimib invertaasile inaktiveerivalt (kuna invertaasile on vaja happelist keskkonda) ja lõpetab reaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks ja moodustab Cu2O. See eraldub punase sademena ja lahusesse jääb vaba triloon B.
Triloon B tiitritakse 0,02M vasksulfaadi lahusega (indikaatorina mureksiidi vesilahus ).
Invertaasi aktiivsus määratakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta.
Antud katses kasutatakse invertaasi asemel vedelat invertiini.
Töö käik:
Suurde katseklaasi (50 ml katseklaas ) pipteerisin sahharoosi hüdrolüüsiks 25 ml 7%-list sahharoosi lahust, mille pH on atsetaatpuhvi abil reguleeritud väärtusele 4,8. Lahus asetasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema umbes 5 – 10 minutiks. Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Invertaasi asemel kasutasin vedelat invertiini. Valmistasin invertiini 20 kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin katseklaasi 0,5 ml invertiini ja pipeteerisin juurde 9,5 ml atsetaatpuhvrit.
Umbes 10 minuti pärast lisasin temperatuurile 30 C termostateeritud sahharoosi lahusele 0,5ml invertiini lahuse lahjendust. Loksutasin ja fikseerisin ensüümreaktsiooni alguse kellaaja.
Koheselt peale ensüümi lisamist võtsin kuiva pipetiga 1 ml hüdrolüüsisegu ja lisasin ühte kolbi, kus oli komplekslahus. See proov oli 0-proov.
10 minutit peale ensüümi lisamist pipeteerisin 1ml reaktsioonisegu teise komplekslahusesse (10 minuti proov).
20 minutit peale ensüümi lisamist pipeteerisin veel 1 ml reaktsioonisegu kolmandasse komplekslahusesse.
Kolvid komplekslahusega, kuhu oli lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid , asetasin 10 minutiks elektripliidile püstjahuti alla keema .
Keetmine lõpetasin 150 ml destilleeritud vee lisamisega kolbi läbi püstjahuti.
Kolb jahutati toatemperatuurini kraanivee all. Antud juhul ei olnud võimalik kasutada 20minuti proovi, kuna lahus oli üleni punane ( tekkinud Cu2O tõttu) ja polnud märgata vaba triloon B. Õppejõu sõnul oleks olnud raske triloon B kogust tiitrimisel kindlaks teha ja sellepärast kasutan oma arvutustes ainult kahte proovi. Põhjust sellele, miks nii juhtus ei oska ma leida, kuna enda arvates ei teinud ma midagi niivõrd valesti.
Reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määrasin 0.02M CuSO4 lahusega tiitrimisel. Enne tiitrimise alustamist lisasin indikaatorina 5 tilka mureksiidi lahust. Kolb värvus indikaatori toimel violetseks. Tiitrisin seni, kuni violetne värvus asendus samblarohelisega.
Tiitrimisele kulunud 0,02M CuSO4 lahuse hulga järgi leitsin kaliibrimiskõveralt taandavate suhkrute sisalduse proovis.
Tiitrimisel saadud andmed:
0-proov: 1,5ml 0,02M CuSO4 lahust
Suhkru kontsentratsioon: 1,3mg/ml
10min-proov: 22,4ml 0,02M CuSO4 lahust
Suhkru kontsentratsioon: 19,8mg/ml
Arvutused
Invertiini aktiivsus arvutan valemi järgi.
Kus,
: Taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis: 19,8
: Taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis: 1,3
: Hüdrolüüsisegu üldmaht: 26ml
1000: tegur üleminekuks mikrogrammidele
T: Hüdrolüüsi kestvus: 600s
180: Glükoosi moolmass
: Proovi maht taandavate suhkrute määramiseks: 1ml
: Uurimiseks võetud invertaasi lahuse maht: 0,5ml
Invertiini aktiivsuse arvutamine:
Kuna antud katses oli kasutatud vedelat invertiini lahuse lahjendust invertaasi asemel, siis tuleb arvutatud aktiivsus korrutada invertiini lahjendusega, et saada invertiini aktiivsus.
Invertaasi aktiivsus on 8,9*20=178 μkat/ml, mis on liiga palju. Sellega järeldub, et midagi oli minul tehtud väga valesti. Võib olla viga oli tehtud kas invertaasi lahuse tegemise käigus või tiitrimise käigus või reagentide kogused ei olnud eriti täpsed.
Kokkuvõte: Järeldub, et invertiini aktiivsuseks saadi 178 μkat/ml .See näitab invertiini kogust, mis produtseerib 1 sekundi jooksul 30°C juures 178 mikromooli taandavat suhkrut. See näitab, et 178 mikromooli sahharoosi hüdrolüüsiti 1 sekundi jooksul.