3.1 Invertaas (0)

Tallinna Tehnikaülikool
YKL0060 Biokeemia
Töö nr 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Yasb  21
Juhendaja Tiina Randla
09.04.2012
Teooria
Invertaas  ehk β-fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside 
ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas 
katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi 
molekule:
    invertaas
 β-D-fruktofuranosi id +H2O     →     β,D- fruktoos  +mono- või oligosahhari d
 Looduses levinuim β-D-fruktofuranosiid on  sahharoos , tema hüdrolüüsiproduktideks on β-D-
fruktoos ja α-D-glükoos. Sahharoos hüdrolüüsub invertaasi toimel vastavalt 
reaktsioonivõrrandile:
Invertaasi akti vsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi 
hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud  taandavate   suhkrute  glükoosi 
ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus.
 Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks kasutatakse nn 
kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireakti viks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, 
mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi.  Kompleks  moodustub  CuSO4  ja triloon B 
ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline 
keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik  leeliseline  komplekslahus 
invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni.
 Hüdrolüüsisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldava proovi  keetmisel  komplekslahusega 
taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades  Cu2O , mis eraldub 
reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon 
B.
Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määratakse ti trimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, 
kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Ti trimisel toimub  reaktsioon , kus  vabanenud 
triloon B komplekseerub uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on 
täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksi di värvuse muutumise järgi. 
Ti trimiseks kulunud CuSO4 hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon 
reaktsioonisegus. Invertaasi akti vus avaldatakse vedela preparaadi korral mikrokatalites 1 
ml kohta (μkat/ml).
Töö käik
Lahustina  kasutatati atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Invertaasi preparaati lahjendatati 
puhvriga 20 korda. Arvutati välja  vedela preparaadi vajalik maht (0,5 ml ensüümilahust, 9,5 
ml tsetaatpuhvrit). 50 ml katseklaasi pipeteeriti 25 ml 7% sahharoosi lahust atsetaatpuhvris. 
Katseklaas  suleti korgiga ning asetati vesitermostaati 30°C juurde umbes 10 minutiks. 
Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteeriti 10 ml komplekslahust . 5 minuti pärast lisati 
termostaadis  soojendatud  substraadile 1 ml invertaasi töölahust, loksutati. Ki resti võeti 1 ml 
lahust ja pandi komplekslahusega kolbi (see oli 0- proov , sel es määratav taandavate 
suhkrute sisaldus näitab hüdrolüüsi alghetke olukorda) ning  töölahus asetati  tagasi 
termostaati. Fikseeriti reaktsiooni alguse aeg. 
10 minutit pärast reaktsiooni algust võeti uuesti 1 ml lahust ning viidi teise komplekslahuse 
kolbi ja 20 minutit pärast reaktsiooni 1 ml lahust kolmandasse kolbi. 
Kolvid ühendati püstjahutiga ning lahuseid keedeti 10 minutit. Seejärel  valati  kolbi läbi 
püstjahuti 150 ml destil eeritud vett ning kolvid jahutati. 
Ti trimiseks lisati kõigisse kolbidesse  esmalt  0,3 ml mureksiidi vesilahust, mil e toimel 
kolvides olev lahus muutus lil aks. 
Ti trimiseks kasutati 0,02 M CuSO4 lahust ning ti triti kuni viimase tilga lisamisel jäi püsima 
lahuse tumeroheline värvus. 
Ti trimisele kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leiti kali brimiskõveralt taandavate suhkrute 
sisaldus proovis.
Invertaasi preparaadi akti vsus (A) μkat/ml arvutatakse valemi järgi:
A = (C2 – C1) · V1 · 103 · L / T · 180 · V3 · V4
kus:
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml,
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml,
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml,
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, ml
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele,
T – hüdrolüüsi kestus, s,
180 – glükoosi molekulmass,
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml,
V4 – ensüümireaktsiooni  viidud  invertaasi töölahuse maht, ml,
L - lahjendusmäär
Invertaasi preparaadi akti vsus avaldatakse kahe akti vsuse aritmeetilise keskmisena, kus 
ühes on ajaks 10 min =  600 s ja teises 20 min =1200 s. Kui töö on läbi viidud korrektselt, 
peaksid tulemused kokku  langema  või erinema teineteisest maksimaalselt 20% võrra. Kui 
akti vsuste erinevus on oluliselt suurem, siis tuleb kindlasti analüüsida, kus võis töös viga 
tekkida.
Tulemused
Ti trimiseks kulunud Cu2SO4 
Taandavate suhkrute 
mahl  (ml)
sisaldus (mg/ml)
0 –  proov
1,6
1,4
10. minuti proov
7,2
6,2
20. minuti proov
14,5
12,8
Invertaasi akti vsus 10. minuti proovis 
Invertaasi akti vsus 20. minuti proovis
Akti vsuste aritmeetiline keskmine
Tulemuste erinevus
Järeldus
1 ml inverti ni akti vsus on 49,56 μkatalit – 1 ml inverti nipreparaadi toimel produtseeritakse 
49,56 μmol taandavat suhkrut sekundis. 
Määratud invertaasi akti vsused peaksid olema enam-vähem sarnased, kuid antud juhul 
erinevad need üksteisest märgatavalt. Järelikult pidi töö läbiviimisel tekkima mingi viga. 
Kõige tõenäolisemalt tekkis suur erinevus ti trimisel.

Document Outline

• Tallinna Tehnikaülikool
• YKL0060 Biokeemia
• Töö nr 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
  • Yasb 21
  • Juhendaja Tiina Randla
  • 09.04.2012
• Teooria
• Töö käik
• Tulemused
• Järeldus