Biokeemia - Invertaas (0)

TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia
Laboratoorne töö nr: 4
Töö pealkiri:
Invertaasi aktiivuse määramine
Õpperühm:
Töö teostaja:
Õppejõud:
Terje Robal
Töö teostatud:
19.03.2012
Protokoll esitatud:
Protokoll arvestatud:
Teooria
Invertaas ehk β-fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis katalüüsib O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib fruktoosi sisaldavate süsivesikute hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:
β-D-fruktofuranosiid + H2O → β, D- fruktoos + mono - või oligosahhariid
Invertaas on oluliseks seedeensüümiks. Teda produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed ja ka mesilased. Aktiivsuse määramisel on reeglina substraadiks sahharoos kui mittetaandatav suhkur. Selle hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus põhinebki invertaasi aktiivuse määramise meetod.
Töö käik

• Invertaasi preparaat, mis kaalutakse analüütilisel kaalul, lahjendatakse atsetaatpuhvriga (pH 4,8) 1 : 50. (0,02 ml preparaati ja u 10 ml atsetaatpuhvrit). Loksutatakse hoolikalt ühtlase segu tekkimiseni.
  
• 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml substraati ( 7 % sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH 4,8) ja kaetakse korgiga .
  
• Katseklaas asetatakse omakorda vesitermostaati 30 kraadi juurde u 5-10 minutiks.
  
• Samal ajal pipeteeritakse kolme koonilisse 250 ml kolbi 10 ml komplekslahust.
  
• Kui termostaadis olev lahus on saavtunad soovitava temperatuuri lisatakse substraadile 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutatakse ja fikseeritakse reaktsiooni algusaeg .
  
• Kohe pipeteeritakse kuiva pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ühte koonilisse kolbi. 10 ja 20 minuti möödudes korratakse tegevust.
  
• Formeerub punane Cu2O sade.
  
• Kolvid asetatakse elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema .
  
• Pärast keetmist lisatakse igasse kolbi 150 ml detilleeritud vett püstjahuti kaudu ning jahutatakse kraanivee all.
  
• Kõikidesse kolbidesse lisatakse 6 tilka indikaatorit mureksiini.
  
• Viiakse läbi tiitrimine CuSO4 , 0,02 M lahusega kuni violetne lahus asendub püsiva rohelisega.
  
• Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus mg/ml.
  

.
Mõõtmistulemused:
Katse
Aeg (min)
Kulunud Cu2SO4
Glükoos (mg/ml)
1
0
3,2
2,8
2
10
11,6
10,3
3
20
19,8
17,5
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml, = 2
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml, =10,3
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml, = 26 ml
10^3 – tegur üleminekuks mikrogrammidele,
T – hüdrolüüsi kestus, s,
180 – glükoosi molekulmass ,
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, 1 ml,
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, 1 ml,
A1= ((10.3-2) x 26 x 1000 x 50) / ( 13 x 60 x 180 x 1 x 1) =76,9 mikrokatalit/ ml
A2=((17,5-2) x 26 x 1000 x 50) / ( 24 x 60 x 180 x 1 x 1) =77,7 mikrokatalit/ ml
Esimene hüdrolüüsi kestvuse viga oli umbes 3 minutit, teisel juhul umbes 1 minut.
Ebatäpsused tulenesid mõõtmisvigadest ja 0-proovi aeglaselt võtmisest, mille tulemusena nihkusid ka teiste proovide ajad.