INVERATSSI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (0)

1 Hindamata

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool

Inveratssi aktiivsuse määramine
Laboratoorsed tööd
Juhendaja : Tiina Randla

Teooria

Invertaas ehk β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi.
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: Invertaas
β-D-fruktofuranosiid + H2O → β,D- fruktoos + mono- või oligosahhariid
Sahharoos on looduses enim levinud β-D-fruktofuranosiid, tema hüdrolüüüsi reaktsiooni produktidena tekivad β,D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produktseerivad pärmid, hallitusseened, mitmed taimed ja mesilased. Invertaas on oluline seedeensüüm, mida toodavad peensoole limaskesta rakud . Invertaasi toimel hüdrolüüsub organismis sahharoos.
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi hüdrolüüsil invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2Co3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks.
Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov . Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja tekib punane Cu2O sade.
Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii:
Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitrimisel komplekseerub triloon B Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimist saab kindlaks määrata indikaator mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi kaliibrimissirgelt. Kui on tegemist vedela ensüümipreparaadiga, siis avaldatakse invertaasi aktiivsus mikrokatalites ensüümilahuse 1 mL kohal, tahke preparaadi korral mikrokatalites 1 g kohta.

Katse käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

Valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Selleks kaausin 0,0108g tahket ainet invertaase ja lisasin sellele 5 mL atsetaatpuhvrit, mille pH oli 4,8. Loksutasin katseklaasi.

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtsin sobiva suurusega katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 ( substraat ). Sulgesin katseklaasi ning panin 10 minutiks vesitermostaati 30⁰C juurde.
Kolme 250 mL-sse koonilisse kolbi, pipeteerisin igasse ühesse 10 mL komplekslahust.
Võtsin termostaadist 30⁰C-ni soojendatud substraadi ning pipeteerisin sinna 1 mL valmistatud invertaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu, siis võtsin kohe 1 mL lahust sealt ning lisasin ühele komplekslahusele kolvis. See oli 0-proov ja iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel .
Reaktsioonisegu katseklaasiga panin kohe tagasi termostaati ning lasin sellel seal olla 10 minutit. Seejärel kordasin toimingut, võttes jälle pipetiga 1 mL reaktsioonisegu ja lisades järgmisesse koonilisse kolbi komplekslahusele.
Panin kolmandat korda reaktsioonisegu tagasi vesitermostaati ja lasin veel olla 10 ning toimisin jälle samamoodi.
Lõpetuseks eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Kolvid , mis sisaldasid komplekslahust ja erinevatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proove, panin elektripliidile püstjahutite alla keema 10 minutiks.
10 minutit pärast keemise algust lõpetasin keetmise lisades läbi püstjahuti kolbidesse 150 mL destilleeritud vett. Vedeliku maht kolvis suurenes ja indikaatori värvuse muutus peaks niimoodi olema paremini märgatav tiitrimisel. Võtsin kolbid pliidilt ja jahutasin kraani all maha.
Lisasin igasse kolbi 6 tilka mureksiidi vesilahust kui indikaatorit, mis andis lahustele õrnalt violetse tooni.
Tiitrisin lahuseid 0,02 M CuSO4 lahusega kuni violetne värvus asendus värvusega. Fikseerisin titrandi kulu, kui märkasin esimest värvi muutust, lõplikult määrasin titrandi kulu kindlaks sellega, kui titrandi lisamisel enam roheline toon ei kadunud, vaid jäi püsima.
Tiitrimistulemused:
V1 = 11,5 mL (0-proov)
V2 = 24,6 mL (ensüümireaktsiooni algusest 10 min-proov)
V3 = 35,8 mL (ensüümireaktsioonialgusest 20 min-proov)
Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimisgraafikult taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 mL-s reaktsioonisegust võetud proovis.
C1 = 10,2 mg/L
C2 = 21,6 mg/L
C3 = 31,6 mg/L
Vedela invertaasi preparaadi uurmisel avaldatakse aktiivsus ensüümipreparaadi 1 mL kohta (μkat/mL).
Aktiivsuse arvutus: , kus
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/mL
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, mL
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, mL
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, sek
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, mL
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, mL
g – ensüümipreparaadi kaalutis, g
Kahe aktiivsuse aritmeetiline keskmine kui invertaasi preparaadi aktiivsus:

Järeldus

Määratud invertaasi aktiivsused peaksid olema enam-vähem sarnased, kuid antud juhul nad erinead 6,06% võrra. Järelikult pidi töö läbiviimisel tekkima mingi viga. Selle põhjuseks võib olla ebatääpne aja jälgimine, kuid kõige tõenäolisemalt tekkis suur erinevus tiitrimisel – titrandi kulu ei määratud piisavalt täpselt, tiitrimist ei lõpetatud kohe värvimuutuse tekkel, mistõttu tekkisid ebatäpsused.

.DOCX Laadi alla originaalfail 5 lk · .docx · 5 allalaadimist

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 5 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2014-09-16 Kuupäev, millal dokument üles laeti

5 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

Vi4uha Õppematerjali autor

töö teoreetilised alused töökäik arvutused järeldus reaktsioon invertaas reaktsioonisegu proov sahharoos fruktoos

Sarnased õppematerjalid

docx

3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Invertaas ehk -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D- fruktofuranosiid + H2O ,D-fruktoos + mono- või oligosahhariid

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseenes, paljud taimed, mesilased. Inimese jaoks on see oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid. Selles töös kasutan komleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool Töö number 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Versioon 1 Töö teostaja: Karina Gailit YAGB 134365 Töö juhendaja: Malle Kreen Tallinn 2014 1 Invertaasi aktiivsuse määramine Teooria Invertaas(-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas, EC 3.2.1.26) on ensüüm,mis kuulub glükosiidsidemete hüdrolaaside hulka. Sellised ensüümid katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi vastavlt skeemile: Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: Sahharoosi hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D- glükoos.

Anorgaaniline keemia

docx

Biokeemia invertaasiaktiivsus

võtmine pidi seetõttu toimuma võimalikult kiiresti. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi. 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi.e Seejärel eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist. 1.5 Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Cu(II) redutseerub taandavate suhkrute toimel ja formeerub Cu 2O punane sade. Samal ajal vabaneb ekvimolaarne kogus triloon B-d. Reaktsioon toimub keemistemperatuuril 1. Asetasin kolvid, mis sisaldasid lisaks komplekslahusele ka erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema. Aega arvestasin keemise algusest, 2. 10 minuti pärast lõpetasin keetmise 150 ml destilleeritud vee valamisega läbi

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Liina Reimann 134537KATB Invertaas ehk β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk β-fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib süsivesikute, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis, hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule.

Bioorgaaniline keemia

docx

Protokoll: Invertaasi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Protokoll Karin Roosiväli 093441KATB41 Juhendaja: Tiina Randla 2011 Invertaasi aktiivsuse määramine Teooria Invertaas ehk -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk -fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib süsivesikute, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis, hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Invertaas -D-fruktofuranosiid + H2O , D-fruktoos + mono- või oligosahhariid

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Invertaas ehk -fruktofuranosidaas on enüüsm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsideme hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavd fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D-fruktofuranosiid + H2O , D-fruktoos + mono- või oligosahhariid

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Biokeemia Laboratoorne töö nr: Töö pealkiri: Invertaasi aktiivsuse määramine. See on teema! 3.1 nr? Töö nimetus? Juhendaja: Töö teostaja: Erki Aun Malle Kreen Õpperühm: Üliõpilaskood: Palun parandada YAGB21 112262 ja täiendada. 09.04. M.K. 3. Biokatalüüs 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine · Töö teoreetilised alused Töö eesmärk oli määrata invertaasi aktiivsus. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhines sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutasin kvantitatiivset meetodit tiitrimist. Antud töös leidis kasutamist nn

Biokeemia

Rohkem sarnaseid

Kommentaarid (0)

Kommentaarid sellele materjalile puuduvad. Ole esimene ja kommenteeri

Kõik kommentaarid