Biokeemia invertaasiaktiivsus (0)

5 VÄGA HEA

INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE

Töö teoreetilised alused

Töö eesmärk

Töö eesmärk oli määrata invertaasi preparaadi aktiivsus, kasutades substraadina sahharoosi. Kasutasin meetodit, kus toimus tänu invertaasi preparaadile sahharoosi hüdrolüüs. Et teada saada invertaasi aktiivsust, määrasin hüdrolüüsi produktide fruktoosi ja glükoosi kontsentratsioonid reaktsioonisegus. Fruktoosi ja glükoosi kontsentratsioonid määrasin triloon – B koguse abil, mille sain teada tiitrimisel.

Teooria

Invertaas ehk β – D – fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk β- fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi vastavalt skeemile:
O – glükosiidside
Glükosidaas
+ H2O + HOR
OR OH
Lühem oligo – või polüsahharid
Oligo- või polüsahhariid Monosahhariid
Invertaas katalüüsib β – D fruktofuranosiide ehk süsivesikuid, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis, hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:
Invertaas
β – D – fruktofuranosiid + H2O β, D- fruktoos + mono – või oligosahhariid
Sahharoos on looduses kõige levinum β – D – fruktofuranosiid ning tema hüdrolüüsi produktid on β – D-fruktoos ja α – D-glükoos.
Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel:
pH 4,8
30ºC
invertaas
H2O
α, D-glükoos β, D-fruktoos
Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutasin kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiivis on selles meetodis tugevalt aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Sellel reaktiivil on käesoleva meetodi läbiviimisel kaks ülesannet: 1) ta lõpetab ensüümireaktsiooni, kuna toimub tugevalt aluseline reaktsioon , mis mõjub invertaasile inaktiveerivalt 2) ta tagab leeliselise keskkonna ja vask(II) – triloon B kompleksi, mis on vajalik taandavate suhkrute määramiseks.
Reaktsioonisegu, mis sisaldab taandavaid suhkruid peab kuumutama, sest siis taandub Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)- eks ning moodustub Cu2O , mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B-d, tänu millele saabki suhkrute kontsentratsiooni määrata.
Keemisel toimuv reaktsioon : O
O
CH2N (CH2COO)2Cu
R C + CH2N(CH2COO)2Cu + 4Na+ + 4OH- R C + Cu(II) – triloon B kompleks
H OH Hape (tekib suhkru oksüdeerumisel)
Taandav suhkur (aldoos/aldoosiks ismoeeriseerunud ketoos
CH2N(CH2COONa)2
CH2N(CH2COONa)2
+ + Cu2O Triloon B
Triloon B kogus määratakse tiitrimise teel, milleks kasutasin vasksulfaadi lahust, millel oli kindel kontsentratsioon. Tiitrimisel komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II) – ioonidega. Kompleksi tekkest saadakse aru tänu lisatud mureksiidi (indikaatori) värvuse muutumise järgi.
Tiitrimisel toimuv reaktsioon:
CH2N(CH2COONa)2 CH2N(CH2COO)2Cu 2Na2SO4
2CuSO4
2CuSO4
CH2N(CH2COONa)2 CH2N(CH2COO)2Cu Cu(II) – triloon B kompleks
Vaba triloon B
Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimissirgelt suhkrute kontsentratsiooni reaktsioonisegus.

Töö käik

Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine

Valmistasin 100 kordse lahjendusega töölahuse. Selleks võtsin 0,5 ml vedelat invertaasi preparaati ja 50 ml atsetaatpuhvrit. Tegin 100 kordse lahjenduse (algselt pidin tegema 50 kordse lahjenduse, kuid võtsin suurema mõõtkolvi ja sealt tuli ka suurem lahjendus). Segasin klaasi sisu 5 minuti vältel klaaspulgaga kuni ühtlase suspensiooni moodustumiseni.

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati ( 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8). Sulgesin katseklaasi korgiga ja asetasin umbes 5 – 10 minutiks vesitermostaati 30 ± 1ºC juurde soojenema.
Võtsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. (Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust(=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, neis määratakse taandavate suhkrute sisaldus).
Kui substraat oli termostaadis saavutanud temperatuuri 30 ºC ( u 5-10 min pärast ), lisasin sellele 2 ml uuritavat invertaasi töölahust, lahuse pidi läbi loksutama ja kiiresti asetama termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse aja kella järgi.
Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahuse ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. See oli 0 – proov , kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel ja proovi võtmine pidi seetõttu toimuma võimalikult kiiresti.
10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi.
20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi.e

Seejärel eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Cu(II) redutseerub taandavate suhkrute toimel ja formeerub Cu2O punane sade. Samal ajal vabaneb ekvimolaarne kogus triloon B-d. Reaktsioon toimub keemistemperatuuril

Asetasin kolvid , mis sisaldasid lisaks komplekslahusele ka erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema . Aega arvestasin keemise algusest,

10 minuti pärast lõpetasin keetmise 150 ml destilleeritud vee valamisega läbi püstjahuti. Sellega suurendasin vedeliku mahtu kolvis, tänu millele oli indikaatori värvuse muutust tiitrimisel paremini näha. Võtsin kolvi pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.

Kõikidesse kolbidesse lisasin indikaatorina 0,3 ml ehk 6 tilka mureksiidi vesilahust, mis annab kolvis olevale lahusele violetse tooni.

Kolbides olevate lahuste tiitrimise viisin läbi 0,02 M CuSO4 lahusega kuni violetne värvus asendus roheka värvusega.
Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis.
Vedela invertaasi preparaadi aktiivsuse arvutamiseks kasutatakse järgnevat valemit:
Kus :
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0 – proovis, mg/ml
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, ml
T – hüdrolüüsi kestus, s
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V4 – ensüümreaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
L – lahjendusmäär
Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena. Selleks arvutatakse katseandmete alusel ensüümi aktiivsus A10, kus C2 taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsiooni 10. minutil võetud proovis ja A20, kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsiooni 20. minutil.
Kui töö on viidud läbi korrektselt, peaksid tulemused kokku langema või erinema maksimaalselt 20 % võrra.

Katseandmed ja arvutused.

Proov
CuSO4 (ml)
Suhkrud (mg/ml)
0 – proov
2,15
1,9
1 – proov
12,7
11,2
2 - proov
23,3
20,7
C1 = 1,9 M μkat/ml
C2 = 11,2 M
C3 = 20,7 M
V1 = 27 ml μkat/ml
V3 = 1 ml
V4 = 2 ml
T1 = 600 s
T2 = 1200 s
L = 100

Kokkuvõte

Katse õnnestus, sest saadud aktiivsused olid peaaegu võrdsed. Vasksulfaadi lahust kulus 2- proovil umbes 2 korda rohkem kui 1- proovil. Tõestasin, et invertaasi aktiivsus ei sõltu ajast.

.DOCX Laadi alla originaalfail 6 lk · .docx · 30 allalaadimist

5 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 5 punkti.

~ 6 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2013-05-01 Kuupäev, millal dokument üles laeti

30 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

olentark Õppematerjali autor

hüdrolüüs reaktsioonisegu tiitrimise fruktoos triloon sahharoosi invertaasi preparaadi

Sarnased õppematerjalid

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Invertaas, süstemaatilise nimetusega -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas, lihtsamalt - fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside e glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseenes, paljud taimed, mesilased. Inimese jaoks on see oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi preparaatide

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool Töö number 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Versioon 1 Töö teostaja: Karina Gailit YAGB 134365 Töö juhendaja: Malle Kreen Tallinn 2014 1 Invertaasi aktiivsuse määramine Teooria Invertaas(-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas, EC 3.2.1.26) on ensüüm,mis kuulub glükosiidsidemete hüdrolaaside hulka. Sellised ensüümid katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi vastavlt skeemile: Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: Sahharoosi hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D- glükoos.

Anorgaaniline keemia

docx

3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Invertaas ehk -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D- fruktofuranosiid + H2O ,D-fruktoos + mono- või oligosahhariid

Biokeemia

docx

INVERATSSI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE

hüdrolaaside hulka, mis katalüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D- fruktofuranosiid + H2O ,D-fruktoos + mono- või oligosahhariid Sahharoos on looduses enim levinud -D-fruktofuranosiid, tema hüdrolüüüsi reaktsiooni produktidena tekivad ,D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produktseerivad pärmid, hallitusseened, mitmed taimed ja mesilased. Invertaas on oluline seedeensüüm, mida toodavad peensoole limaskesta rakud. Invertaasi toimel hüdrolüüsub organismis sahharoos. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi hüdrolüüsil invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit.

Keemia

pdf

Invertaasi aktiivsuse määramise protokoll 2020

INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.1) Protokoll Sissejuhatus Invertaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib β-D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Looduses kõige levinum β-D-fruktofuranosiidid on sahharoos, mille hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad hallitusseened, paljud taimed ning ka mesilased. Invertaas on inimese jaoks oluline seedeensüüm. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Preparaadi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava preparaadi toimel vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus.

Kategoriseerimata

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Invertaas ehk -fruktofuranosidaas on enüüsm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsideme hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavd fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D-fruktofuranosiid + H2O , D-fruktoos + mono- või oligosahhariid

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Biokeemia Laboratoorne töö nr: Töö pealkiri: Invertaasi aktiivsuse määramine. See on teema! 3.1 nr? Töö nimetus? Juhendaja: Töö teostaja: Erki Aun Malle Kreen Õpperühm: Üliõpilaskood: Palun parandada YAGB21 112262 ja täiendada. 09.04. M.K. 3. Biokatalüüs 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine · Töö teoreetilised alused Töö eesmärk oli määrata invertaasi aktiivsus. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhines sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutasin kvantitatiivset meetodit tiitrimist. Antud töös leidis kasutamist nn

Biokeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

1. Töö teoreetilised alused Invertaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsideme hüdrolüüsi vastavalt skeemile: Invertaas katalüüsib hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades fruktoosi molekule: Sahharoos on looduses levinuim -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi toodavad pärmid, hallitusseened, taimed ja mesilased. Inimesele on ta oluline seedeensüüm. Invertaasi aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina tavaliselt sahharoosi. Meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsoonisegus. Antud töös kasutatakse glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemisel

Biokeemia

Rohkem sarnaseid