Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Laboratoorne töö III
Üliõpilane: Meelika Lukner (155308)
Kuupäev: 11.03. 2016
Invertaasi aktiivsuse määramine
Invertaas ehk β-D-fruktofrunaosiidi fruktohüdrolaas ehk β-fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosidaaside hulka. Need katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi.
β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsi käigus, mida katalüüsib invertaas, vabanevad fruktoosimolekulid.
Invertaasi produtseerivad pärmid , hallitusseened, taimed ja mesilased . Looduses enim levinud β-D- fruktofuranosiid on sahharoos , mis hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel.
Invertaasi meetodi määramise meetod põhineb sahharoosi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarsete kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Viimaste suhkrute kontsentratsiooni määramine tehakse kindlaks kompleksomeetrilisel meetodil, kus põhireaktiiv, mis on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kompleks valmistatakse Na2CO3 lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA -Na –d (etüleen-diamiintetraäädikhappe dinaatriumi sool). Kuna see lahus on tugevalt aluseline ning invertaasi optimaalne pH on 4,8, siis mõjub see lahus inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samuti on taandavate suhkrute määramiseks vajalik leeliseline keskkond ja vask(II)-triloon B kompleks.
Reaktsioonisegust kindlal ajahetkel võetud proov , mis sisaldab taandavaid suhkruid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub kompleksis sisalduv vask(II) suhkrute toimel vask(I)-ks. Seejärel moodustub Cu2O, seda on näha punase sademena, mis tekib sinise lahuse põhja. Ekvivalentses koguses jääb lahusesse vaba triloon B.
Vabanenud triloon B tiitritakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega. Stöhhiomeetrilise punkti määramiseks lisatakse indikaatorina mureksiidi, mis värvub selles punktis roheliseks.
Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse eelnevalt juba koostatud kaliibrimissirgelt taandavata suhkrute kontsentratsiooni. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta.
Töö käik
Valmistan töölahuse tahkest preparaadist. Selle jaoks kaalun analüüilisel kaalul juhendaja näpunäite järgi 10 mg (tegelikult kaalusin 0,0103 g ehk 10,3 mg) tahket invertaasi ja viin mahu 5 ml-ni. Lahjenduseks kasutan atsetaatpuhvrit (pH=4,8). Segan gradueeritud katseklaasi sisu klaaspulgaga, kuni tahke aine on enam-vähem ära lahustunud. Selget lahust siin ei teki, kuna ensüümpreparaat sisaldab lisaks ensüümivalgule ka muid valke ja täiteaineid .
Seejärel võtan 50 ml mahuga katseklaas ja pipeteerin sinna 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris (pH=4,8). Panen katseklaasile korgi peale ning asetan selle 10 minutiks vesitermostaati 30o juurde soojenema.
Võtan kolm koonilist kolbi, mahuga 250 ml. Pipeteerin sinna 10 ml komplekslahust (CuSO4 ja EDTA-Na Na2CO3 lahuses).
Võtan termostaadis 10 minutit seisnud sahharoosi lahuse ja lisan sinna 1 ml invertaasilahust. Loksutan hoolikalt läbi ning võtan koheselt 1 ml proovi ja lisan selle ühte komplekslahuse kolbi. Ülejäänud sahharoosilahuse asetan tagasi termostaati seisma 10 minutiks.
Pärast 10 minutit võtan sahharoosilahuse termostaadist taaskord välja ning pipeteerin sellest 1 ml lahust teise komplekslahuse kolbi. Asetan sahharoosilahuse veel 10 minutiks termostaati ning pipeteerin pärast seda ka kolmandasse kolbi 1 ml lahust.
Lõpuks on mul 3 kolbi, milles ühes on invertaasi aktiivsuse 0-proov ning teises kahes 10 minutiliste vahedega võetud proovid .
Seejärel liidan kõik kolm kolbi püstjahutitega ning keedan 10 minutit (aega arvestan keemise algusest). 10 minuti pärast lõpetan keetmise 150 ml destilleeritud vee valamisega läbi kolvi püstjahuti ning jahutan kolvid kraanivee all.
Sean büretid töökorda, valades vajadusel 0,02 M CuSO4 lahust büretis 0-ni. Lisan kolvis olevatele lahustele 0,3 ml ehk 6 tilka mureksiidi vesilahust, mille tagajärjel värvuvad lahused tumesiniseks/violetseks.
Tiitrin kõik kolm kolbi ning saan tulemuseks (alustades 0-proovist ja lõpetades termostaadis kõige kauem seisnud lahusega):

2,61 ml – kaliibrimisgraafiku järgi on suhkrute sisaldus C1=2,33 mg/mL

4,60 ml – C2=4,05 mg/mL

6,55 ml – C3=5,75 mg/mL
P.S. Kolmanda proovi titrandi hulk oleks pidanud tulema suurem, kuid juhendaja nõuandel peaksin saama sellegipoolest edasisi arvutusi läbi viia.
Siit saan edasi arvutada invertaasi aktiivsuse A10, kus on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsioonil 10. minutil ja A20, kus on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsioonil 20. minutil. Nende kahe tulemusel arvutan preparaadi aktiivsuse läbi nende aritmeetilise keskmise.
A10 = = = 188,15 μkat/ml
A20 = = = 240,16 μkat/ml
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis
C2 – taandavate suhkrute sisaldus 10. minutil võetud proovis
C3 – taandavate suhkrute sisaldus 20. minutil võetud provis
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht
G – ensüümipreparaadi kaalutis
Avaldan invertaasi aktiivsuse aritmeetilise keskmisena.
A = = = 214,155 μkat/ml
Järeldus
Antud töö katsetulemused polnud ideaalsed. Teoorias oleks pidanud 10 ja 20 minuti järel taandavaid suhkruid lahuses rohkem olema, kuid antud katses see välja ei tulnud. Siinkohal võib kahtlustada invertaasi vähest aktiivsust, mis võis olla tingitud näiteks vähesest lahustumisest atsetaatpuhvris (osad tahked tükid võisid jääda katseklaasi seintele ja invertaasilahus võis olla lahjema kontsentratsiooniga ). Üldiselt, langevad arvutused kokku pigem kenasti ja teen järelduse, et antud invertaasilahuse kontsentratsioon oli lihtsalt liiga madal.