Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Laboratoorne töö 3.1
Invertaasi aktiivsuse määramine
Töö teostaja
Õpperühm
Üliõpilaskood
Töö teostamise kuupäev
06.03.13
Juhendaja
Tiina Randla
Protokolli esitamise kuupäev
18.03.13
Teooria
Invertaas on on ensüüm , mis kuulub glükosidaaside hulka ning katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsiraktsiooni, vabastadesneist molekule:
Invertaas on inimese jaoks oluline seedeensüüm ning seda ensüümi produtseerivad pärmis, paljud taimed, hallitusseened ja ka mesilased. Sahharoos on looduses levinuim β-D-fruktofuranosiid, mis hüdrolüüsil annab β-D-fruktoosi ja α-D-glükoosi. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel vastavalt:
Invertaasi aktiivsuse määramiseks kasutatakse sageli substraadina sahharoosi.
Aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanevate suhkrute ( glükoosi ja fruktoosi) summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoos on teatavasti mittetaandav disahhariid , glükoos ja fruktoos aga taandavad monosahhariidid .
Antud töös kasutasin glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kompleksomeetrlist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldas vask (II)-triloon-B kompleksi. Komplekslahus täidab aktiivsuse määramisel kaht rolli:

Tänu aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt = 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümreaktsiooni

Tagab vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon-B kompleksi.
Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov viiakse kompleklahusesse. Kompleksis sisalduv Cu(II) taandub keemistemperatuuril Cu(I)-ks ja moodustub vask(II)oksiid. Cu2O eraldub punase sademena. Alles jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B.
Vabanenud triloom-B kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kasutatakse 0,02 M vasksulfaadi lahust. Protsessi käigus komplekseerub triloon-B uuesti Cu (II) ioonidega. Lahusesse lisatud indikaator mureksiid muutub rohekaks, kui vastav kompleks on tekkinud.
Tiitrimisel toimuv reaktsioon :
Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse mahu järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldataks e mikrokatalites ensüümlahuse 1 ml kohta.
Töö käik
Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine

• Automaatpipeti abil viiakse gradueeritud katseklaasi 0,25 ml vedelat ensüümpreparaati.
  
• Katseklaas täidetakse 10 ml-ni puhverlahusega.
  
• Katseklaas suletakse korgiga ja loksutatakse kontsentratsiooni ühtlustamiseks.
  

Ensüümreaktsiooni läbiviimine

• 50 ml katseklaasi pipetaaritakse 25 ml substraati: 7% sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH-ga 4,8.
  
• Katseklaas suletakse korgiga ning asetatakse 5-10 minutiks vesitermostaati soojenema.
  
• Kolme 250 ml koonilisse kolmgi pipeteeritakse 10 ml komplekslahust.
  
• Kui substraat on termostaadis vastava aja soojenenud, võetakse see välja ning lisatakse 1 ml uuritavat invertaasi töölahust ja loksutatakse.
  
• Kohe pärast reaktsioonisegu loksutamist võetakse sellest pipetiga 1 ml lahust ja viiakse 1 kolbi, kus komplekslahus. See on 0- proov .
  
• Katseklaas asetatakse kiiresti termostaati tagasi ja fikseeritakse ensüümreaktsiooni alguse aeg.
  
• 10 min pärast reaktsiooni algust võetakse segust 1 ml ja viiakse teise komplekslahuse kolbi. Reaktsioonisegu asetatakse termostaati tagasi.
  
• 20 min pärast reaktsiooni algust võetakse veel 1 ml segu ja viiakse kolmandasse kolbi.
  

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

• Kolvid komplekslahuse ja erinevatel aegadel võetud proovidega asetatakse elektripliidile püstjahutite alla keema . Keedetakse 10 minutit, kusjuures aega arvestatakse keemise algusest.
  
• Min pärast lõpetatakse keetmine ja lisatakse 150 ml destilleeritud vett läbi püstjahuti kolbi, et vedeliku maht kolvis suureneks ja tiitrimisel indikaatori värvuse muutus oleks paremini nähtav.
  
• Kolb eemaldatakse pliidilt ja jahutatakse kraanivee all toatemperatuurini
  
• Kui kõik kolvid on 10 min keenud ja jahutatud, lisatakse kõikidesse kolbidesse indikaatorina 0,3 ml mureksiidi vesilahust. Mureksiid annab lahustele violetse värvuse.
  
• Kolbides olevate lahuste tiitrimine toimub 0,02 M Cu2SO4 lahusega, kuni violetne värvus muutub püsivaks rohekaks värvuseks. Titrandi kulu fikseeritakse kohe kui värvus natukenegi muutub. Kui roheline värv kaob lisatakse titranti veel ettevaatlikult tilk haaval ja kui värvus jääb püsima fikseeritakse lõplik kulu.
  

Tiitrimiseks kulunud 0,02M Cu2SO4 lahuse mahu järgi leitakse kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus proovides.
Inveraati preparaadi aktsiivsus (A) arvutatakse:
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0 – proovis
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis
V1 – reaktsioonisegu üldmaht
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht
103 - tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks
V4 – ensüümreaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht
L – lahjendusmäär
Tööks kasutasin vedelat invertiini ja valmistasin 40 kordse lahjeduse.
Katse- ja arvutustulemused
Tiitrimiseks kulunud Cu2SO4 mahud:

0 – proovis: 3,6 ml

10 min – proovis: 17,8 ml

20 min – proovis: 30,5 ml
Taandavate suhkrute sisaldused:

0 – proovis: 3,2 mg/ml

10 min – proovis: 18,5 mg/ml

20 min - proovis: 24,03 mg/ml
Aktiivsus A10 :
C1 = 3,2 mg/ml
C2 = 15,8 mg/ml
V1 = 1 + 25 = 26 ml
V2 = 10 ml
T = 10 min = 600 s
V3 = 1 ml
V4 = 1 ml
L = 40
Aktiivsus A20:
C2 = 24,03 mg/ml
T = 20 min = 1200 s
Invertaasi aktiivsus A
Kokkuvõte
Ivertaasi aktiivsus antud ensüümpreparaadis on 110,82 μkat/ml. Töös võis tekkida väike viga, kuna 0-proovi tiitrimine ei õnnesutunud hästi. Titraadi kogus oleks pidanud olema natuke väiksem. Üldiselt arvan et arvutatud aktiivsus on reaalne ja ei erine palju tegelikust. 10 min proovi ja 20 min proovi aktiivsus ei erine üksteisest rohkem kui 20 %.