Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Invertaas , süstemaatilise nimetusega β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas, lihtsamalt β-fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside e glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule.
Sahharoos on looduses kõige levinum β-D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on β-D- fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseenes, paljud taimed, mesilased . Inimese jaoks on see oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid . Selles töös kasutan komleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. See valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola. See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kaht rolli: tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni; tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi.
Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov , mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0.02M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vaba triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varemkoostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1ml kohta.
TÖÖ KÄIK:
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine.
Töölahuse maht on 10 ml ning vedela preparaadi maht on 1:40 ehk 10/40=0.25 ml. Mõõtsin selle automaatpipetiga katseklaasi ning lisasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4.8. Sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin.
Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine.

• Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4.8.Panin katseklaasile kile peale ja asetasin umbes 5-10 minutiks vesitermostaati 30+-1 kraadi juurde soojenema.
  
• Võtsin 3 koonilist kolbi (250ml) ja pipeteerisin neisse 10 ml komplekslahust. Viisin kolbidesse reaktsioonisegust kindlatel aegadel võetud proovid , et neis määrata taandavate suhkrute sisaldus.
  
• Kui substraat oli termostaadis saavutanud vajaliku temperatuuri, lisasin sellele 0.5 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutasin lahuse läbi ja asetasin katseklaasi kiiresti termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse.
  
• Kohe peale reaktsioonisegu loksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. See oli nn 0-proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel .
  
• 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi.
  
• 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi.
  

Reaktsiooniproduktide määramine ja aktiivsuse arvutamine
Cu(II) redutseerub taandavate suhkrute toimel ja formeerub punane Cu2O sade. Samal ajal vabaneb ekvimolaarne kogus triloon B. Reaktsioon toimub keemistemperatuuril.

• Kolvid, mis lisaks komplekslahusele sisaldasid nüüd ka erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, asetasin elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema .
  
• 10 minuti pärast lõpetasin keetmise 150 ml destilleeritud vee valamisega kolbi läbi püstjahuti. Sellega suurenes ka vedeliku maht kolvis. Võtsin kolvid pliidilt, jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.
  
• Lisasin kõikidesse kolbidesse indikaatorina 0.3 ml ehk 6 tilka mureksiidi vesilahust, mis andis kolvisolevale lahusele violetse tooni.
  
• Kolbides oleva lahuse triitimise viisin läbi 0.02M CuSO4 lahusega kuni violetne värvus asendub selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Tiitrimise käigus loksutasin kolvi sisu pidevalt.
  

Tiitrimiseks kulunud 0.02M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kalibreerimissirge järgi taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis.
0-proovi tiitrimiseks kulus 0.9 ml triloon B lahust, glükoosi konsentratsioon 0.8 mg
10 minuti pärast võetud proovi tiitrimiseks kulus 9,4 ml triloon B lahust, glükoosi sisaldus 8.3 mg
20 minuti pärast võetud proovi tiitrimiseks kulus 17.1 ml triloon B lahust, glükoosi sisaldus 15.1 mg.
Invertaasi preparaadi aktiivsus (A) μkat/ml arvutatakse valemi järgi:
A=((C2-C1)*V1 *10³*L)/(T*180*V3*V4)
C1-taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis C1=0.8mg
C2-taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis. C10min=8.3mg;C20min=15.1mg.
V1-reaktsioonisegu üldmaht. V1=25.5ml
V2-ensüümi töölahuse üldmaht. V2=10ml
10³-tegur üleminekuks mikrogrammidele.
T-hüdrolüüsi kestus. T10=600, T20=1200
180-glükoosi molekulmass .
V3-proovi maht taandavate suhkrute määramiseks. V3=1 ml.
V4-ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht. V4=0.5ml.
L-lahjendusmäär, mida kasutati vedelast ensüümipreparaadist töölahuse valmistamisel. L=40.
Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena. Selleks arvutan A10, kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsi 10 minutil võetud proovis:
A10=((8.3-0.8)*25.5*10³*40)/(600*180*1*0.5)=141.7
Ja A20, kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsi 20 minutil võetud proovis:
A20=((15.1-0.8)*25.5*10³*40)/(1200*180*1*0.5)=135.1
Kui töö on läbi viidudkorrektselt, peaksid tulemused kokku langema või erinema teineteisest maksimaalselt 20% võrra.
Nende kahe erinevus on 100%-(135.1*100/141.7)=5%.
Leian kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmise: (141.7+135.1)/2=138.4.
Ensüümiaktiivsus 138.4 näitab, et 1 sekundi jooksul 30 kraadi juures produtseeritakse 138.4 mikromool produkti, antud juhul 1mikromool taandavat suhkrut.