Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Martin Tamm (121006YASB)
Biokeemia protokoll
Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia protokoll
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Martin Tamm / 121006YASB
Ensüümideks nimetatakse polüpeptiidilisi valke mille toimeks on tõsta reaktsioonikiirust ehk neid nimetatakse bioloogilisteks katalüsaatoriteks. Looduses on erinevaid ensüüme millel on oma süstemaatiline nimetus ja triviaalnimetus. Süstemaatilist nimetust saab ensüümidele ära määrata Ensüümi klassifikatsiooni järgi ( Enzyme Classification). Süsteem leiutati aastal 1956 Rahvusvahelise Ensüümi Komissiooni (International Comission of Enzymes) poolt. Klassifikatsioonis määratakse ära missuguse ensüümiga on tegemist ja millega too reageerib. Ensüümi klassifikatsioonis on kuus peamist rühma millel on oma nimetus olemas:

Oksüreduktaasid mille funktsiooniks on redoksreaktsioonid ehk elektronide ülekanne.

Transferaasid mille funktsiooniks on funktsionaalsete rühmade ülekanne ühelt molekulilt teisele.

Hüdrolaasid ehk keemiliste sidemete katkestamine hüdrolüüsi teel.

Lüaasid ehk kaksiksidemete teke rühmade kõrvaldamise teel või liitumisreaktsioonid kaksiksidemele.

Isomeraasid ehk isomeersete molekulide teke ühest molekulist.

Ligaasid ehk uute kovalentsete sidemete moodustamine kondensatsiooni teel ATP energia arvel.
Kõik ensüümid on vastavalt ära määratud kasutades neid ülemisi liigitamisgruppe. Kui antakse ensüümile süstemaatiline nimetus siis nimetuses on neli tähte peale initsiaale E.C. Näiteks:
ATP + D-glükoos  ADP + D-glükoos-6- fosfaat
ATP molekul ja D-glükoos reageerivad mille käigus ATP kaotab ühe fosfaat rühma ja ensüümi abil see liidetakse glükoosile ehk siis D-glükoosist saab D-glükoos-6-fosfaat. Süstemaatiline nimetus ensüümile mis liidab fosfaatrühma glükoosile on: ATP:D- heksoos fosfotransferaas (E.C. 2.7.1.1) ehk siis triviaalnimetusega heksokinaas. Number 2 näitab ära, et tegu on transferaasiga, ehk siis funktsionaalrühma ülekanne. Number 7 näitab ära, et tegu on fosfotransferaasi alamklassiga kuna fosfaatrühm kantakse üle ühelt molekulilt teisele. Kolmanda numbri number 1 näitab ära, et fosforüülrühma aktseptoriks on hüdroksüülrühm. Neljanda numbri number 1 näitab ära, et fosforüülrühma aktseptoriks on D-heksoosi hüdroksüülrühm.
Selles protokollis kajastatud katse oli tehtud ensüümiga mille triviaanimetuseks on Invertaas (süstemaatiline nimetus: beta -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas). Invertaasi ülesandeks on hüdrolüüsida beta-D-fruktsofuranosiidi süsivesikuid fruktoosideks ja muudeks monosahhariidideks.
Invertaas
Beta-D- fruktofuranosiid + H2O → beta, D-fruktoos + mono - või oligosahhariid
Selles praktikumis teostati töö sahharoosiga mis koosneb beta-D-fruktoosist ja alfa-D-glükoosist.
Sahharoos + H2O → alfa-D-glükoos + beta-D-fruktoos
* - Invertaas, pH=4,8 , temperatuur = 30 ºC
Invertaas on suhteliselt tähtis seedeensüüm inimestel. Kuna sahharoos on oligosahhariid siis inimorganism ei ole võimeline seda vereringlusesse võtma kuna molekul on lihtsalt liiga suur, et organismi sisse imenduda. Invertaas hüdrolüüsib sahharoosi vastavateks produktideks mida inimorganism saab kasutada energia allikana .
Produktide koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodid mis hõlmab tiitrimist triloon-B, CuSO4 ja Na2CO3 seguga. Invertaasi optimaalseks pH-ks on 4,8 aga kuna tiitrimisel kasutatav segu on tugevalt aluseline siis invertaas lõpetab oma töö hüdrolüüsimisel.
Kindlatel ajahetkedel võetakse reaktsioonisegu proov , mis sisaldab taadavaid suhkruid ja pannakse komplekslahusesse. Keemine on ka vajalik protsess töökäigus kuna kompleksis sisalduv Cu(II) taandub Cu(I)-ks ja tekib Cu2O sade. Reaktsioon on järgmine:
R-CHO + Cu(II)-triloon B kompleks + 4Na+ + 4OH-  R-COOH + triloon B + Cu2O
Triloon B koguse saab ära määrata tiitrimise teel kasutades 0,02 molaarset vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus tekitab vaba Triloon B uuesti sidemeid Cu(II) ioonidega mis on nähtav ka värvuse muutumises kui on lisatud mureksiidi lahust. Mureksiid ehk ammoonium purpuraat on indikaator tumesinise värvusega mida lisatakse komplekslahusesse, et värvuse muutust märgata. Tiitrimise reaktsioon kulgeb järgmiselt:
Vaba triloon B + 2CuSO4  Cu(II)-triloon B kompleks + 2Na2SO4
Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus kasutades kalibreerimissirget mis on eelnevalt valmist tehtud. Ensüümi aktiivsuse ühik on mikrokatal (µkat). Üks mikrokatal võrdub 1 sekundi jooksul tehtud 1 mikromool produkti 30 kraadi celsiuse järgi.
TÖÖ KÄIGUD
Töö käigud koosnevad kolmest osast: ensüümipreparaadi valmistamine, ensüümireaktsiooni läbiviimine ja tiitrimine ehk taandatud suhkru kontsentratsiooni määramine. Vajalikud töövahendid, ained ja nende kogused on töökäigus ära märgitud.

Ensüümpreparaadi valmistamine
Vajalikud töövahendid

• Automaat pipett (kuni 1ml-ne)
  
• väike keeduklaas tahke invertaasi koguse kaalumiseks
  
• gradueeritud katseklaas kuhu läheb invertaasi ja atetaatpuhvi lahus
  
• analüütiline kaal (0.0001 grammi täpsusega)
  
• väike lusikas invertaasi üle kandmiseks
  
• väike klaaspulk invertaasi-puhvi lahuse segamiseks
  

Vajalikud ained

• 9,5 mg tahket invertaasi
  
• 2,4 ml atsetaatpuhvrit (pH = 4,8)
  

Töö käik

Kasutades analüütilist kaalu, kaaluda ära 9,5 mg tahket invertaasi väiksesse keeduklaasi.

Kanda üle invertaasi gradueeritud katseklaasi ja panna katseklaasi 2,4 ml atsetaatpuhvri lahust.

Klaaspulga abil läbi segada lahus kuni tekib ühtlane hägusus ja suspensioon (tükid võivad sees olla).

Gradueeritud katseklaasile panna kork peale ja ettevaatlikult läbi loksutada katseklaasi sisu.
Ensüümi ja puhvri vaheline seos tahke invertaasi puhul on 1 mg tahket invertaasi ja 4 ml puhverlahust. Ma võtsin 9,5 mg tahket invertaasi ja 2,4 ml puhvrit.
m(tahke invertaas) = 9,5 mg
V(puhverlahus) = 2,4 ml

Ensüümireaktsiooni läbiviimine
Vajalikud töövahendid

• 50 ml katseklaas kuhu pipeteeritakse sahharoosi lahus ja kuhu pannakse ensüümi preparaat.
  
• Kolm 250 ml-list koonilist kolbi kuhu pannakse komplekslahus ja teatud aja jooksul võetud proovid (PEALE MÄRKIDA MIS AJAL VÕETUD PROOV ON).
  
• Stopper aja jälgimiseks
  
• Automaat pipett uuritava invertaasi lahuse pipeteerimiseks
  
• Vesi termostaat kuhu pannakse sahharoosi-invertaasi lahus soojenema (30±1ºC)
  
• Pipett substraadi ülekandmiseks
  

Vajalikud ained

• 25 ml 7%-list sahharoosi lahust mis on läbi segatud puhverlahusega
  
• 30 ml komplekslahust (10 ml igasse koonilisse kolbi)
  
• 3,0 ml sahharoosi-invertaasi lahust (1,0 ml igasse koonilisse kolbi)
  
• 0,5 ml uuritavat invertaasi lahust
  

Töö käik

Võetakse 50 ml mahuga katseklaas kuhu pipeteeritakse 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris).

Katseklaasile pannakse kork peale ja katseklaas pannakse umbes 5-10 minutiks termostaati soojenema (30±1ºC).

Võetakse kolm 250 ml-list koonilist kolbi kuhu pipeteeritakse 10 ml komplekslahust (NB! Komplekslahus on leeliseline!). Kolvid ära märkida markeriga: „0-proov“, „10 minutit“ ja „20 minutit“.

Kui substraat on saavutanud temperatuuri siis võtta katseklaas termostaadist välja ja sisse pipeteerida 0,5 ml uuritavat invertaasi lahust kasutades automaat pipetti. Lahus loksutatakse läbi ja võetakse 1 ml reaktsiooni segu mis pannakse ühte koonilisse kolbi milles on komplekslahus sees („0-proov“).

Kohe pärast loksutamist ja katseklaasi termostaati tagasi panemist käivitada stopper.

Kui 10 minutit on mööda saamas siis võtta 1 ml reaktsioonisegu katseklaasist ja panna „10 minutit“ kolbi kus on komplekslahus sees. Katseklaas ise ruttu panna tagasi termostaati!

Kui 20 minutit on mööda saamas siis võtta 1 ml reaktsioonisegu uuesti katseklaasis ja panna „20 minutit“ kolbi kus on komplekslahus sees.

Katseklaasi võib termostaadist ära võtta.
V(komplekslahus) = 30 mL kokku
V(sahharoos-invertaas lahus) = 3,0 mL kokku
V(uuritava invertaasi lahus) = 0,5 mL
V(substraat e. Sahharoosi lahus) = 25 mL

Aktiivsuse määramine
Vajalikud töövahendid

• Elektripliit kolbide kuumutamiseks
  
• Püstjahutid lahuse kondenseerumiseks
  
• 200 mL mõõtesilinder
  
• Automaat pipett
  
• Külm vesivann
  
• Tiitrimise aparatuur
  
• Lehter
  

Vajalikud ained

• 450 mL destilleeritud vett lahuste lahjendamiseks
  
• 0,3 mL ehk 6 tilka mureksiidi lahust violetse tooni andmisteks kolbides olevates lahustes
  
• Vasksulfaat
  

Töö käik

Koonilised kolvid panna elektripliidi peale ja ära ühendada püstjahutitega.

Panna elektripliit tööle ja oodata millal kolvi sees olevad lahused hakkavad keema . Lasta lahustel keeda 10 minutit ja aega VÕTTA ALATES SELLES KUI LAHUSED KEEVAD!

Mõõta 150 mL destilleeritud vett iga kolvi jaoks.

Kui 10 minutit on möödas keemisest siis valada 150 mL destilleeritud vett kolvidesse kasutades lehtrit.

Pärast keetmist panna kolvid külma veevanni kuni nad saavutavad toatemperatuuri.

Kõikidesse kolvidesse panna 6 tilka ehk 0,3 mL mureksiidi. Kolvisisu võtab violetse tooni.

Alustada tiitrimist 0,02M CuSO4 lahusega kuni violetset tooni asendab rohekas toon. Kui rohekas toon on ilmunud kohe kirja panna vasksulfaadi lahuse ruumala mis kulus tiitrimiseks. Pärast lisada paar tilka vasksulfaadi lahust juurde, et kindlas teha õige ruumala.

Ära määrata taandavate suhkrute sisaldus lahustes kasutades kalibreerimissirget mida saab juhendaja käest.

Arvutada ära invertaasi aktiivsus kasutades järgmist valemit:
A= [(C2-C1) x V1 x V2 x 103] / (T x 180 x V3 x V4 x g)
Kus,
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
V1 – reaktsioonisegu üldmaht, ml
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, ml
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
G – ensüümipreparaadi kaalutis, g
Tabel 1. Tiitrimise tulemused ja invertaasi aktiivsused teatud aja jooksul.
Algnäit (ml)
Lõppnäit (ml)
Vahe (ml)
Suhkrusisaldus
(mg/ml)
Aktiivsus
(µkat/g)
0-proov
0,9
3,1
2,2
2
10 minutit
3,3
11,5
8,2
7,3
583,6
20 minutit
3,6
17,9
14,3
12,7
600,7
A(10 minutit) = [(7,3-2) x 25,5 x 2,4 x 103] / (650* x 180 x 1 x 0,5 x 0,0095) = 583,6 µkat/g
A(20 minutit) = [(12,7-2) x 25,5 x 2,4 x 103] / (1275* x 180 x 1 x 0,5 x 0,0095) = 600,7 µkat/g
Avg: (583,6 + 600,7) / 2 = 592.2 µkat/g
Viga: (│583,6 – 600,7 │x 100%) / 600.7 = 2.85%
Analüüs
Tabel 1-st võib välja lugeda, et mida kauem oli invertaas sahharoosi lahuse sees, seda suuremaks läks CuSO4 maht tiitrimise ajal, et värvuse erinevus tekiks. CuSO4 lahuse ruumala suurenemine kajastab taandatud monosahhariidide hulka proovis. Kuna temperatuur ei olnud tegur mis oleks saanud invertaasi aktiivsust muuta siis mõlema ajaproovi aktiivsuse peaksid olema enamvähem samad. Invertaasi aktiivsus nii 10 minuti ja 20 minuti vältel suutsid püsida enamvähem samad. Mõnikümmend mikrokatalit grammi kohta siia sinna.
Vea protsendiks tuli 2,85 protsenti mis on enamvähem lubatav. Invertaasi aktiivsuse määramisel võis sisse tulla mitu erinevaid vea allikaid nagu näiteks: tiitrimise ebatäpsus, ajastuse ebatäpsus. Tiitrimisel oli palutud, et lahus mis sisaldas komplekslahust, invertaasi-sahharoosi lahust ja mureksiidi lahust oleks saavutanud rohekama tooni. Tiitrimisel on tilga täpsus oluline invertaasi aktiivsuse määramisel. Katseklaasid kus olid tiitrimised tehtud said natukene tumedama roheka tooni kui mõeldud oli. Ajastuse ebatäpsus võib ka kajastuda invertaasi erinevuses. Juhendis on kindlaks tehtud, et katse sooritaja ikka suudaks ajaga toime tulla. Ajanappus on ka aktiivsuse arvutamisel kajastatud, et 600 ja 1200 sekundi asemele on pandud natukene suuremad arvud.
Kokkuvõte
Laboratoorse töö eesmärk oli ära määrata invertaasi aktiivsust kasutades tahket ensüümi mis oli lahustatud atsetaatpuhvris ja substraadiks oli 7%-line sahharoosi lahus. Invertaas on hüdrolaas ehk ta lõhustab sahharoosi kaheks taandavaks monosahhariidideks: glükoosiks ja fruktoosiks. Ensüümi aktiivsus hõlmas ajastuse täpsust sellega, et iga viie minuti aja tagant oli vajalik võtta teatud kogus reaktsioonisegu ja panna see ümarkolbi kus on komplekslahus sisse pandud. Pärast proovide kogumist pandi kolvid keema kümneks minutiks ja keemist lõpetati destilleeritud vee lisamisega. Pärast destilleeritud vee lisamist kolve jahutati. Pärast jahutamist lisati 5-6 tilka mureksiidi ja alustati tiitrimisega 0,02M vask(II)sulfaadi lahusega. Tiitrimise kaudu saadi teada ensüümi aktiivsust arvestades vask(II)sulfaadi ruumalaga ja kasutades kalibreerimis graafikut, et ära määrata suhkru sisaldus teatud proovis. Valem oli etteantud aktiivsuse määramiseks.
9