Invertaasi aktiivsus (0)

TTÜ Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060
Laboratoorne töö:
nr. 4
Töö pealkiri:
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Õpperühm:
YAGB22
Töö teostaja :
Õppejõud:
Malle Kreen
Töö teostatud:
3.05.2010
Protokoll esitatud:
13.05.2010

3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine

Töö teoreetilised alused:
Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib β,D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni. Skeem: β,D- fruktofuranosiid + H2O → alkohol + fruktoos
Kõige levinum invertaasi substraat on sahharoos (koosneb α,D-glükoosist ja α,D-fruktoosist).
Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, ka paljud taimed, inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskestas toodetava invertaasi toimel.
Invertaasi aktiivust määratakse sahharoosi ja mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisega, mille põhjustab uuritav ensüümipreparaat. Reaktsioonisegus detekteeritakse vabandenud taandavad monosahhariidid glükoos ja fruktoos.
Sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon invertaasi toimel:
Reaktsiooduproduktid detekteeritakse komplektsomeetrilise meetodiga (põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi).
Invertaasi toimeks on vajalik happeline keskkond, seega komplekslahus toimub invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni.
Hüdrolüüsisegust võetakse proovid (sisaldavad taandavaid suhkruid), neid keedetakse ja vask(II) taandub vask(I)-ks, moodustub Cu2O, see eraldub segust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.
Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid.
1 μkat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30⁰C juures 1 μmol taandavat suhkrut (kutsub esile 1 μmol sahharoosi hüdrolüüsi).
Töö käik:
Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimine: pipeteerisin 100 ml katseklaasi 25 ml 7 %-list sahharoosi lahust (substraat, mille pH on atsetaatpuhvriga reguleeritud väärtusele 4,8) ja asetasin selle vesitermostaati 30⁰C juurde soojenema (10 minutit).
Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin tahket invertaasi (Invertaas, 3.2.1.26), valmistasin 5 ml lahust kontsentratsiooniga 2-3 mg/ml – selleks võtsin 0,0140 g invertaasi ja lahustasin selle puhvris.
Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute määramiseks: pipeteerisin kolme 250 ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust.
Soojenenud sahharoosi lahusele lisasin 1 ml uuritavat lahust, loksutasin ja käivitasin stopperi.
Koheselt peale ensüümi lisamist võtsin 1 ml hüdrolüüsisegu ja lisasin ühte komplekslahuse kolbi (0- proov ). 10 ja 20 minuti pärast võtsin uuesti 1 ml hüdrolüüsisegu ja lisasin ülejäänud kahte komplekslahust sisaldavasse kolbi.
Asetasin komplekslahuse ja hüdrolüüsisegu sisaldavad kolvid elektripliidile püstjahuti alla 10 minutiks keema . Toimus vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel.
Keetmise lõpetasin 150 ml dest. vee lisamisega läbi püstjahuti. Jahutasin kolvid jooksva vee all.
Määrasin reaktsioonil vabanenud triloon B koguse 0,02 M CuSO4 lahusega tiitrides, enne lisasin igasse kolbi indikaatorina 6 tilka mureksiidi lahust. Tiitrisin kuni violetne värvus asendus püsivalt samlarohelisega.
Kaliibrimiskõvera abil leidsin kulunud CuSO4 hulga järgi taandavate suhkrute sisalduse proovis.
Invertaasi aktiivsuse arvutasin valemi järgi:
A = (C1 – C2) * V1 * 1000 / T * 180 * V2 * V3
10 minuti proov
20 minuti proos
C1 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis
9,4 mg
16,8 mg
C2 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis
0,8 mg
0,8 mg
V1 – hüdrolüüsisegu üldmaht
26 ml
26 ml
1000 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
1000
1000
T – hüdrolüüsi kestus
600 s
1200 s
180 – glükoosi moolmass
180
180
V2 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks
1 ml
1 ml
V3 – uurimiseks võetud invertaasi lahuse maht
1 ml
1 ml
A (10 min) =
A (20 min) =
Kahe tulemuse keskmine: 1,99 (1 ml lahuse kohta)
5 ml lahuse kohta: 1,99 * 5 = 9,95
Invertaasi aktiivsus: 9,95 / 0,014 = 710,71 μkat/ml
Järeldus:
Proovides sisaldusid taandavad suhkrud .
Taandavate suhkrute sisaldus kasvas (võrreldes 0, 10 ja 20 minuti proove).
Invertaasi aktiivsus oli 710,71 μkat/ml.