Biokeemia praktikumi töö nr. 3.1 - INVERTAAS

Truumees, Birgit

Biokeemia praktikumi töö nr. 3.1 - INVERTAAS (0)

3 KEHV

YKL0060 Biokeemia
Töö number: 3.1
Töö nimi: Invertaasi aktiivuse määramine
Töö teostaja:
Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk
Töö teostatud: 25.02.2013

Invertaasi aktiivsuse määramine
Invertaas (β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk β-fruktofuranosidaas) on ensüüm, mis kuulub glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi:
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni ning vabastab neist fruktoosi molekule:
Sahharoos , mida kasutatakse reeglina invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel substraadina, on looduses levinuim β-D-fruktofuranosiid, millest peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel hüdrolüüsudes tekivad β-D-fruktoos ja α-D-glükoos:
Invertaasi aktiivsust määratakse sahharoosi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Saadud produktide koguse kindlaks määramiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks tugevalt aluseline lahus, kus on vask(II)-triloon B kompleks . Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile muudab ta invertaasi, mille pHopt=4,8, inaktiivseks ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samas tagab ta ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi.
Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldav proov viiakse komplekslahusesse ning keedetakse, mille käigus taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena sadenev Cu2O ning lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B:
Jägnevalt tuleb määrata tiitrimise teel triloon B kogus, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust ning indikaatorine mureksiidi. Tiitrimisel komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ning seda näitab ka indikaator :
Kulunud CuSO4 koguse järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1g kohta.
Töö käik:

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Valmistan 4ml lahust ensüümi kontsentratsiooniga 3mg/ml (lahusesse 12mg) tahkest ensüümipreparaadist. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit pH=4,8. Ensüümi kaalun analüütlilisel kaalul, viin kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi, lisan vajaliku puhvri koguse ning segan umbes 5 minutit klaaspulgaga ühtlase lahuse tekkimiseni.

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtan 50ml katseklaasi, kuhu pipeteerin 25ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Sulgen katseklaasi korgiga ja panen katseklaasi 5-10 minutiks vesitermostaati umbes 30 0C juurde soojenema.
Pipeteerin kolme 250ml koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust.
Kui substraat on teermostaadis saavutanud temperatuuri 30 0C, lisan sellele 1ml uuritavat invertaasi töölahust ja loksutan.
42 sekundit pärast reaktsioonisegu loksutamist võtan sellest kuiva pipetiga 1ml lahust ja viin ühte komplekslahusega kolbi, see on 0-proov. Asetan katseklaasi tagasi termostaati.
10min pärast ensüümireaktsiooni algust võtan sama pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja viin selle teise koonilisse kolbi komplekslahusesse.
20min pärast ensüümireaktsiooni algust võtan sama pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja viin selle kolmandasse koonilisse kolbi komplekslahusesse.
Eemaldan reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Vastavalt ülaltoodud reaktsiooniskeemile reutseerub Cu(II) keemistemperatuuril taandavate suhkrute toimel ja tekib punane Cu2O sade.

Kolvid, kus on komplekslahusele lisatud ka reaktsioonisegust võetud proovid , panen elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema .
10min hiljem lõpetan keetmise 150ml destilleeritud vee lisamisega lahusele läbi püstjahuti. Võtan kolvi pliidilt ja jahutan voolava vee all toatemperatuurile.
Kõikidesse kolbidesse lisan indikaatoriks 0,3ml mureksiidi lahust, mis annab violetse tooni.
Lahuseid tiitrin 0,02M CuSO4 lahusega violetse värvi roheliseks muutumiseni.
Kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leian kaliibrimisgraafikult taandavate suhkrute sisalduse milligrammides ühes milliliitris reaktsioonisegust võetud proovis.
Arvutan invertaasi preparaadi aktiivsuse (A) µkat/g valemi järgi:

, kus
C2 - taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
V1 - reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml
V2 - ensüümi töölahuse üldmaht, ml
103 - tegur üleminekuks mikrogrammidele
T - hüdrolüüsi kestus, s
180 - glükoosi molekulmass
V3 - proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V4 - ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
G - ensüümipreparaadi kaalutis, g

Avaldan invertaasi preparaadi aktiivsuse kahe aktiivsuse (A10, kus T=600s, ja A20, kus T=1200s) aritmeetilise keskmisena.

Arvutuskäik:
Järeldus:
Töö oli läbi viidud korrektselt, sest leitud aktiivsused A10 ja A20 erinesid üksteisest tunduvalt vähem kui 20% võrra. Mina sain, et invertaasi preparaadi aktiivsus on 427,86µkat/g.

.DOCX Laadi alla originaalfail 3 lk · .docx · 91 allalaadimist

Biokeemia praktikumi töö nr-3 1 - INVERTAAS #1

Biokeemia praktikumi töö nr-3 1 - INVERTAAS #2

Biokeemia praktikumi töö nr-3 1 - INVERTAAS #3

50 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 50 punkti.

~ 3 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2013-03-05 Kuupäev, millal dokument üles laeti

91 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

Birgit Truumees Õppematerjali autor

Biokeemia praktikumi protokoll invertaasi aktiivsuse määramise kohta

invertaas biokeemia biokeemia praktikum reaktsioonisegu invertaasi suhkrute proov ensüümireaktsiooni triloon sahharoosi preparaadi aktiivsus

Sarnased õppematerjalid

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

3.1. Invertaasi aktiivsuse määramine Invertaas, süstemaatilise nimetusega -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas (EC 3.2.1.26) on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidenete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktoduranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid,

Keemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Invertaas, süstemaatilise nimetusega -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas, lihtsamalt - fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside e glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseenes, paljud taimed, mesilased. Inimese jaoks on see oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi preparaatide

Biokeemia

pdf

Invertaasi aktiivsuse määramise protokoll 2020

INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.1) Protokoll Sissejuhatus Invertaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib β-D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Looduses kõige levinum β-D-fruktofuranosiidid on sahharoos, mille hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad hallitusseened, paljud taimed ning ka mesilased. Invertaas on inimese jaoks oluline seedeensüüm. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi

Kategoriseerimata

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

järgi Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. INVERTAASI AKTIIVSUS: - VEDEL ensüümpreparaat: avaldatakse mikrokatalites ensüümilahuse 1 ml kohta () - TAHKE ensüümpreparaat: avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta (). NB! 1 - ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jookul 30°C juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1), st 1 taandavat suhkrut. 3.1.1. Töö käik ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: TÖÖLAHUSE MAHT 10 ml LAHJENDUSMÄÄR 40x lahjendus VEDELA PREPARAADI VAJALIK MAHT 10 ml/40 = 1/4= 0,25 ml ENSÜÜMREAKTSIOONIKS 0,5 ml

Keemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Töö nr 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Koostas: Juhendaja: Mart Reimund Teoreetilised alused Invertaas (-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk EC 3.2.1.26) kuulub glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Looduses on kõige levinumaks -D-fruktofuranosiidiks sahharoos. Inimesele on see oluline seedeensüüm, invertaasi toimel hüdrolüüsib sahharoos. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi (mittetaandav) hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi (taandavad) summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus

Füüsikaline ja kolloidkeemia

docx

Invertaasi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Liina Reimann 134537KATB Invertaas ehk β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk β-fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib süsivesikute, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis, hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Invertaas β-D-fruktofuranosiid + H2O → β, D-fruktoos + mono- või oligosahhariid Looduses on kõige levinumaks β-D-fruktofuranosiidiks sahharoos. Sahharoosi hüdrolüüsi produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid,

Bioorgaaniline keemia

docx

Protokoll: Invertaasi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Protokoll Karin Roosiväli 093441KATB41 Juhendaja: Tiina Randla 2011 Invertaasi aktiivsuse määramine Teooria Invertaas ehk -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk -fruktofuranosidaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib süsivesikute, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis, hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Invertaas -D-fruktofuranosiid + H2O , D-fruktoos + mono- või oligosahhariid Looduses on kõige levinumaks -D-fruktofuranosiidiks sahharoos. Sahharoosi hüdrolüüsi produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi toodavad pärmid, hallitusseened, paljud taimed, mesilased

Biokeemia

docx

3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Invertaas ehk -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: -D- fruktofuranosiid + H2O ,D-fruktoos + mono- või oligosahhariid

Biokeemia

Rohkem sarnaseid