TTÜ Biokeemia praktikum: Invertaas (0)

TÖÖ 3.1: INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE

Juhendajad:
Kaia Kukk
Priit Eek
Teooria
Invertaas , süstemaatilise nimetusega β-D-fruktofuranoosi fruktohüdrolaas ehk lihtsamalt β-fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükoosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib β-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist β-fruktoosi molekule.
Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsoonisegus.
Antud töös kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kompleks valmistatakse kõrge kontsentratsiooniga Na2CO3-st, CuSO4 -st ja triloon B-st (etüleen-diamiintetraäädikhappe dinaatriumi sool).
Kuna reaktiiv on tugevalt aluseline, lõpetab ta invertaasi ensüümireaktsiooni.
Peale invertaasi reaktsiooni on reaktsioonisegus taandavad suhkrud . Segu viiakse komplekslahusesse, kompleksis sisalduv Cu(II) taandub sukrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O , mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B, mille kogus määratakse tiitrimise teel kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust. Tiitrides tekib uuesti Cu(II) kompleks, määratakse lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Tiitrimiseks kulunud CuSO4 hulga järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1ml ensüümilahuse kohta.
Töö käik

• Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
  
  • invertiini lahust võetalse 0,4ml
    
  • invertiini lahjendatakse 25x (kokku lahust 10ml)
    
  • lahustiks kasutatakse atsetaatpuhvrit pH 4,8
    
• Ensüümireaktsiooni läbiviimine
  
  • 50ml katseklaasi pipeteeritakse 25ml substraati (7% sahharoos atsetaatpuhvris)
    
  • katseklaas varustatakse korgiga
    
  • katseklaas 10 minutiks vesitermostaati 30 kraadi juurde soojenema
    
  • võetakse 3 250ml koonilist kolbi, kuhu pipeteeritakse 10ml komplekslahust
    
  • 10min pärast lisatakse substraadile 0,5ml invertaasi töölahust, loksutatakse läbi ja asetatakse tagasi termostaati
    
  • kohe pärast segu läbiloksutamist võetakse sellest 1ml lahust ja viiakse ühte komplekslahuse kolbi (0- proov )
    
  • järgmised 2 proovi võetakse 10 ja 20 minuti möödudes invertaasi lisamisest
    
  • reaktsioonisegu eemaldatakse termostaadist
    
• Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
  
  • Cu(II) taandamine ja Cu2O sademe teke toimub keemistemperatuuril
    
  • proovidega kolvid asetatakse elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema
    
  • aega arvestatakse keemise algusest
    
  • 10min pärast lõpetatakse reaktsioon 150ml destilleeritud vee valamisega kolbi
    
  • kolb jahutatakse kraanivee all toatemperatuurini
    
  • kolbidesse lisatakse 5-6 tilka 0,3% mureksiidi, mis annab violetse värvuse
    
  • tiitritakse 0,02M CuSO4 lahusega roheka värvuseni
    
  • tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku abil taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s proovis.
    
  • Arvutatakse invertaasi aktiivsus mikrokatalites 1ml kohta
    

0-prooviga kolb kahjuks purunes , mistõttu läks tulemus kaduma, seega arvutan aktiivsuse ülejäänud katsete tulemuste põhjal.
Tulemused
aeg
Vasksulfaadi maht
Suhkrute kontsentratsioon
10 min
11,20 mL
9,9 mg/mL
20 min
22,05 mL
18,45 mg/mL
Järeldus: kasutatud invertaaasipreparaadi aktiivsus on 100,9
mis tähendab et 1ml invertiini katalüüsib 1 sekundis 30 kraadi juures 100,9 mikromooli sahharoosi glükosiidsideme hüdrolüüsi, mille käigus tekib β- fruktoos ja glükoos. Katse tulemus oleks võinud olla täpsem, kui oleks saanud arvutusel kasutada ka 0-proovi.