Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö Nr. 3.1
Protokoll
Invertaasi aktiivsuse määramine
Töö Teostaja : Ann Lakspere
Üliõpilaskood: 120959YASB
Juhendaja : Tiina Randla
Kaia Kukk
Töö teostatud: 20.02.2013
Tallinn 2013
INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
(3.1.)
Teooria
Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib β,D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni
vastavlt skeemile:
β,D-fruktofuranosiid + H2O → alkohol + fruktoos
Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos , mis koosneb α,D-glükoosist ja β,D-fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel.
Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Vastavalt toodud skeemile leiab invertaasi toimel aset sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon . Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks kasutatakse siin nn kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik leeliseline komplekslahus invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni.
Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.
Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades
indikaatorina mureksiidi vesilahust.
Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (µkat/ml).
Töö käik

Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võetakse 50 ml katseklaas , kuhu pipeteeritakse 25 ml 7%- list sahharoosi lahust(substraati), mille pH on 4,8 (reguleeritud atsetaatpuhvri abil). Lahus asetatakse vesitermostaati 30ºC juurde soojenema (5-10 min). Tehakse ka uuritav invertaasi lahus. selleks kaalutakse 0,025 g tahket invertaasi ja lahustatakse seda atsetaatpuhvris 5 ml-ni (pH = 4,8). Ensüümi kontsentratsioon lahuses tahkel preparaadil on 5mg/ml kohta.

Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme

koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust.

5-10 min. pärast võetakse sahharoosi lahus termostaadist ning lisatakse 1 ml uuritavat invertaasilahust., loksutatakse ja asetatakse katseklaas termostaati tagasi ning käivitatakse stopper või fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi.

Kohe peale ensüümi lisamist võetakse kuiva pipetiga 1 ml hüdrolüüsisegu ja viiakse ühte kolbidest, kus on komplekslahus. Selles määratav taandaavate suhkrute sisaldus iseloomustab 0-proovi. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteeritakse 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ja 20 min. pärast kolmandasse kolbi.

Kolvid reaktsiooniseguga asetatakse 10 minutiks elektripliidile püstjahuti alla keema . Keemistemperatuuril toimub vase redutseerimine taandavate suhkrute toimel. Keetmine lõpetatakse 150 ml destilleeritud vee lisamisega kolvidesse läbi püstjahuti. Kolvid võetakse pliidilt ja jahutatakse kraanivee all toatemperatuurini.

Reaktsioonil vabanenud triloon-B kogus määratakse 0,02 M CuSO4 lahusega tiitrimisel. Enne tiitrimise alustamist lisatakse igasse kolbi 0,3 ml(umbes 6 tilka) mureksiidi vesilahust, mille toimel värvus kolvi sisu violetseks. Tiitritakse seni, kuni kolvi sisu muutub intensiivselt roheliseks.

Tiitrimisele kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimiskõveralt taandavate suhkrute sisaldus proovis.
Tulemuste analüüs
Tiitrimiseks kulunud 0,02M CuSO4 lahuse hulga järgileitakse taandavate suhkrutesisaldus proovis Invertaasi aktivsuse leitakse kasutades valemi:
A= ( C2 – C1) × V1 × V2 × 103 / T ×180 × V3 × V4 × g
kus:
C2 – taandavate suhkrute sisaldus aja hetkel T võetud proovis, mg/ml
C1 – taandavate suhkrute sialduse 0 – proovis, mg(ml
V1 – hüdrolüüsisegu üldmaht, ml
1000 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V4 –ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml.
G – ensüümipreparaadi kaalutis, g
V(CuSo4), ml
C (mg/ml)
0- proov
2,9
2,6
1- proov
9,7
8,6
2-proov
17,9
15,8
A1 = (8,6mg/ml – 2,6mg/ml) × 26ml × 5ml × 103 / 910s × 180 × 1ml ×1ml × 0,025g = 190,48 μkat/g
A2 = (15,8mg/ml – 2,6mg/ml) × 26ml × 5ml × 103 / 1510s × 180 × 1ml ×1ml × 0,025g = 252,54μkat/g
A = A1 + A2 / 2 = 190,48 + 252,54 / 2 = 221,51 μkat/g
Järeldus
Tulemus näitab, et töö ei olnud läbi viidud korrektselt, mille tõttu sain suured erinevused aktiivsuste vahel. Viga tuli sisse 0-proovi võtmise käigus, kui ajasin segamini magnetpipetid ning võtsin 1ml asemel 0,5ml magnetpipeti. Sobiliku pipeti leidmisele ning lõpuks proovi võtmisele kulus palju aega ning 0-proov, mida oli rõhutatud, et tuleb võtta võimalikult kiiresti, võtsin mina 5 min 10s hiljem reaktsiooni toimumise ajast. Sellega seoses tuli viga sisse ka edasistes proovides, kus 10min ja 20min proovidele tuli samuti otsa arvestada kulunud aeg. Siit tuli kõige rängem ning suurem viga, kuid ei saa välistada, et viga võis suureneda ebatäpse tiitrimise või reagentide koguste lisamisel. Siit sain õppetunni, et enne katse alustamist ei piisa sellest, kui panna valmis vajalikud ained ja vahendid, vaid neid tuleb enne siiski üle kontrollida, eriti kui on tegemist aja peale katsetega.