Valkude ja süsivesikute kvalitatiivsed reaktsioonid (1)

1. Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega Kvalitatiivsete reaktsioonidega on võimalik määrata, kas mingi keemiline element, funktsionaalne rühm, ühend või ühendite rühm leidub uuritavas proovis või mitte. Katse läbiviimisel reaktsioon vastavalt kas toimub või ei toimu, mida saab täheldada värvuse muutusega, sademe või hägu moodustumisega, gaasi eraldumisega või muude silmaga nähtavate muutuste toimumisega.
1.1 Valkude reaktsioonid 1.1.1 Biureedireaktsioon
Reaktsioon toimub, kui aine sisaldab vähemalt kahte peptiidsidet .
Leeliselises keskkonnas annab valk Cu(II) ioonidega sinakasvioletse, valgu mittetäieliku hüdrolüüsi produktid aga roosa värvusega biureedikompleksi.
Cu2+ ioonid seostuvad nelja peptiidsideme koostisesse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist.
Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisati 1 ml 10% NaOH lahust ja mõni tilk 1% CuSO4 lahust.
Tulemus: CuSO4 lisamisel muutus lahus lillakaks
Järeldus: Munavalgu lahuses esinesid peptiidsidemed
1.1.2 Ksantoproteiinreaktioon (Mulderi reaktsioon)
Reaktsioon näitab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Phe, Trp, Tyr) esinemist valgus. Lämmastikhappe mõjul valk denatureerub. Soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine, tekkinud ühend on kollaka värvusega, mis leeliselises keskkonnas omandab oranzi värvuse.
OH - O O OH O 2N NO 2 O 2N N 2HNO3 OH- O + H2 O Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisati 5-6 tilka konts. HNO3 . Segu soojendati kuni kollase värvuse saavutamiseni. Lisati NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni.
Tulemus: HNO3 lisamisel tekkis valge sade ning soojendamisel muutus segu kollakaks, NH4OH lisamisel värvus muutus intensiivsemaks, lõpuks oranziks.
Soojendamisel toimus aromaatsete tuumade nitreerumine, mis tingis kollaka värvuse tekke. Moodustunud ühend käitub hape /alus indikaatorina ning leeliselise NH4OH lisamisel omandas segu oranzi värvuse.
Järeldus: Munavalgu lahuses sisaldusid aromaatsete tuumadega aminohapped
1.1.3 Milloni reaktsioon
Reaktsiooniga saab kindlaks teha fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavate aminohapete sisaldumist (Tyr radikaalid). Positiivse Milloni reaktsiooni annab enamik valke, denatureerunud valgu sade värvub roosakaks.
OH O OHg
HNO3 + Hg(NO3)2 O 2N N O + 2H2O
Töö käik: Ühte katseklaasi valati 1 ml munavalgu, teise 1 ml zelatiini lahust. Kummassegi lisati 5-6 tilka Milloni reaktiivi (Hg(II)nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga). Segusid soojendati 40-50°C-ni.
Tulemus: Milloni reaktiivi lisamisel tekkis munavalgu lahuses sade, soojendamisel värvus sade roosakaks. Zelatiini lahuses muutusi ei toimunud.
Järeldus: Munavalgu lahuse koostises esines türosiin, zelatiini lahuses mitte
1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Reaktsiooniga saab tõestada tsüsteiini (Cys) esinemist valgus. Leeliselise hüdrolüüsiga annab tsüsteiini radikaalis sisalduv tioolrühm (-SH) sulfiidioone, mis Pb2+ ioonidega moodustavad musta või tumepruuni PbS sademe.
H2N O + H2O H2N O CH C + 2NaOH CH C + Na 2S + H2O HS CH2 OH HO CH2 OH
Töö käik: 2 ml 0,5% Pb( CH3COO )2 lahusele lisati tilgakaupa 10% NaOH lahust kuni Pb(OH)2 sademe kadumiseni ning Na2PbO2 moodustumiseni. Seejärel lisati 1 ml munavalgu lahust ning segu soojendati, kuni moodustus pruunikasmust PbS sade.
2 Tulemus: Segu kuumutamisel hakkas tekkima pruun sade, sademe tekkimine jätkus ka katseklaasi statiivi seisma jätmisel
Järeldus: Munavalgu lahuses esineb tioolrühma sisaldav tsüsteiin.
1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape denatureerib ja sadestab lahusest välja valke, mille molekulmass on üle 10 000. Kasutatakse valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikuühenditest. Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisati mõni tilk CCl3COOH lahust, loksutati
Tulemus: Moodustus valge sade
Järeldus: Toimus valgu väljasadenemine munavalgu lahusest TKÄ abil, seega valgu molekulmass on üle 10000.
1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Valkude pöörduvat denaturatsiooni nind väljasadestumist põhjustavad neutraalsete soolade kõrged kontsentratsioonid. Globuliinid sadestuvad välja (NH4) 2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinid aga soola küllastunud lahuses.
Töö käik: 2 ml munavalgu lahusele lisati sama palju (NH4)2SO4 küllastunud lahust ning jäeti see 5 min seisma. Tekkinud sade eraldati filtrimisega . Filtraadile lisati vähehaaval kristalset (NH4)2SO4 kuni soola kristallid enam ei lahustunud.
Tulemus: (NH4)2SO4 küllastunud lahuse lisamisel tekkis nõrk hägu. Kristalse (NH4)2SO4 lisamisel filtraadile tekkinud albumiinide sade oli intensiivsem
Järeldus: Tekkinud sademehulkade põhjal saab öelda, et albumiinide sisaldus munavalgus oli suurem
1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahuse sõltuvus pH-st
Kõrgel tempetatuuril toimub kõigi valkude pöördumatu denaturatsioon , millega kaasneb enamasti ka valgu väljasadestumine. See ei pruugi aga toimuda, kui keskkonna pH erineb palju valgu isoelektrilise täpi väärtusest.
Valgu pI on keskkonna pH väärtus, mille juures valgu molekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne, molekuli summaarne laeng võrdub seega nulliga, millest tingituna valgumolekulid sadestuvad kergesti lahusest välja. Kui keskkonna pH erineb väga palju pI väärtusest, omandavad kõik molekulid ühesuguse laengu, mistõttu väljasadestumist ei toimu.
Töö käik: Kahte katseklaasi valati 2 ml munavalgu lahust. Ühte lisati 1 ml konts äädikhapet. Katseklaase kuumutati keeval vesivannil
Tulemus: Katseklaasis, kuhu oli lisatud äädikhapet, valgu väljasadestumist ei toimunud, teises katseklaasis tekkis sade.
Järeldus: Happe lisamine ühte katseklaasi põhjustas pH muutuse, mis erines valgu isoelektrilisest täpist, mistõttu väljasadestumist ei toimunud.
3 1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustega
Orgaanilised lahustite nagu etanool, atsetoon jt mõjul toimub valgu dehüdratiseerumine ning väljasadestumine. Sadesti ettevaatlikul lisamisel toimuv denaturatsioon on pöörduv ning sade lahustub uuesti vee lisamisel. Suuremas koguses lahusti lisamisel toimub pöördumatu denaturatsioon ning sade vee lisamisel ei lahustu.
Töö käik: 2 ml munavalgu lahusele lisati tilgakaupa etanooli kuni sademe tekkeni. Seejärel lahjendati katseklaasi sisu veega
Tulemus: Veega lahjendamisel tekkinud sade ei lahustunud
Järeldus: Valguga toimus pöördumatu denaturatsioon, ilmselt lahusti liiga kiire lisamise tõttu.
1.2 Süsivesikute reaktsioonid
1.2.1 Molisch'i test Reaktsiooniga saab määrata nii mono -, oligo- kui polüsahhariidide esinemist. Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad ning moodustavad kas furfuraale või 5-hüdroksümetüülfurfuraale. - naftooliga reageerides tekib purpurne kiht uuritava lahuse ning happe piirile.
Töö käik: Ühte katseklaasi valati 2 ml fruktoosi ja teise 2 ml glükoosi lahust. Lisati 5-6 tilka Molisch'i reaktiivi (-naftooli C10H7OH lahus alkoholis). Hoides katseklaasi kaldu, lisati tilgakaupa 1 ml konts väävelhapet, nii et see voolaks mööda katseklaasi külge põhja lahuse alla.
Tulemus: Fruktoosilahuse ja happe piirpinnale tekkis lillakas kiht ning glükoosilahuse ja happe piirpinnale õrnalt rohekas -lilla kiht.
Järeldus: Reaktsiooniga tõestati sahhariidide olemasolu uuritavates lahustes.
1.2.2 Osasoonide saamine Osasoonid tekivad redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Osasoonid kristalluvad lahusest välja, tekkinud kristallide kuju järgi on võimalik eristada lähtesuhrkuid.
Töö käik: Ühte katseklaasi valati 2 ml laktoosi, teise 2 ml glükoosi lahust. Lisati 0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati ning loksutati lahustumiseni. Segu kuumutati ~40 min keeval veevannil kuni osasoonide moodustumiseni. Osasoonide kuju vaadeldi mikroskoobis.
Tulemus: Glükoosi lahuses tekkisid osasoonid kiiresti, laktoosi lahusest osasoone saada ei õnnestunud.
4 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli . Ammoniakaalsest AgNO3 lahusest sadestub metalliline hõbe taandavate suhkrute toimel välja ning katseklaasi seinale moodustub peegel .
Töö käik: 1 ml 1% AgNO3 lahusele lisati 0,5 ml NH4OH lahust, loksutati. Lisati 1 ml glükoosi lahust ning segu soojendati veevannis.
Tulemus: Taandunud hõbe sadestus õrnalt katseklaasi seintele
Järeldus: Glükoosis sisaldub aldehüüdrühm, mis redutseeris metalli AgNO3 lahusest
AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv [Ag(NH3)2]+ (diammiinhõbe)
1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega Fehlingi reaktiiviga saab määrata taandavate suhkrute olemasolu. Reaktsioonil vaba aldehüüd- või ketorühma toimel vask(II)tartaatkompleksi koostises olev vask taandub ning tekib punane Cu2O sade. Sahharoos ise Fehlingi reaktiiviga ei reageeri ( pole taandav suhkur), aga reageerivad sahharoosi hüdrolüüsiproduktid glükoos ja fruktoos .
Na O O
HO C Na C O O CH O CH Cu(OH) 2 + Cu + 2H2O CH O CH O HO C K O C O O K K,Na-tartaat e Segnett'i sool Fehlingi reaktiiv
Na Na O O O C C O O OH CH CH - CH OH Cu CH + R O + 2OH Cu 2O R + C +2 HO CH O O punane sade O C taandav suhkur C suhkru oksüdatsioonil O O O K K tekkinud hape
Töö käik: Kahte katseklaasi valati 1 ml sahharoosi lahust, ühte lisati veel 1 tilk konts HCl. Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks kuumutati mõlemat lahust 5 min jooksul veevannil. Mõlemasse katseklaasi lisati 1 ml Fehling I (CuSO4 vesilahus) ja Fehling II( leeliseline K,Na-tartraadi e Seignetti soola vesilahus) lahust. Seejärel kuumutati uuesti mõlemat katseklaasi.
5 Tulemus: Fehlingi lahuste lisamisel muutus mõlemas katseklaasis lahus siniseks . Teistkordsel veevannis kuumutamisel tekkis katseklaasis, kuhu oli lisatud HCl, punane sade.
Järeldus: Happe lisamine kiirendas sahharoosi hüdrolüüsi, mistõttu andis selles katseklaasis Fehlingi reaktiiv positiivse reaktsiooni taandavate suhkrute suhtes.
1.2.5 Barfoed'i reaktsioon Barfoed'i reaktiiviga (vask(II)atsetaadi lahus äädikhappes) saab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgalt happelises keskkonnas taandavad vaske ainult monosahhariidid .
Töö käik: Ühte katseklaasi valati 1 ml fruktoosi, teise 1 ml maltoosi lahust. Lisati 3 ml Barfoed'i reaktiivi ning kuumutati veevannil ~5 min.
Tulemus: Pärast mõneminutilist kuumutamist tekkis fruktoosilahust sisaldavas katseklaasis punane sade.
Järeldus: Fruktoos kui monosahhariid taandas vaske, tekkis punane Cu2O sade. Maltoos kui oligosahhariid vaske neis katsetingimustes ei taandanud.
1.2.6 Selivanoff 'i reaktsioon Suhkrute kuumutamisel tugevate mineraalhapete juuresolekul moodustub pentoosidest furfuraal ja heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal . Mitmealuseliste fenoolidega reageerides moodustuvad nendest värvilised produktid. Selivanoff'i reaktiiv koosneb soolhappest, benseen -1,3-dioolist ja FeCl3- st.
O O pentoosid CH
furfuraal
O O HO CH heksoosid
- - 5 hüdroksümetüül furfuraal
Töö käik: Ühte katseklaasi valati 1 ml fruktoosi, teise 1 ml glükoosi lahust. Lisati 2 ml Selivanoff'i reaktiivi ning soojendati ~5 minutit keeval veevannil.
Tulemus: Fruktoosilahust sisaldavas katseklaasis muutus lahus paari minuti jooksul punakaks, glükoosilahust sisaldavas katseklaasis peaaegu 5 min jooksul õrnalt roosakaks.
Järeldus: Fruktoos on ketoos ning glükoos aldoos ­ fruktoosiga toimus reaktsioon kiiremini.
6 1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga Tärklis moodustab joodiga intensiivselt lillakas-siniseid komplekse, mis kõrgemal temperatuuril lagunevad ja kaotavad värvuse.
Töö käik: 4-5 ml tärkliselahusele lisati 1 tilk joodilahust. Segu kuumutati keemiseni. Seejärel katseklaasi alumine pool jahutati jäävannis.
Tulemus: Joodi lisamisel lahusesse tekkis tugev sinine lahus. Kuumutamisel muutus lahus värvusetuks. Katseklaasi alumise poole jahutamisel hakkas taastuma sinine värvus.
Maisitärklis Kartulitärklis
Mikroskoobiga vaadeldes võrreldi erinevate tärkliseliikide kuju ja suurust. Maisitärklise terad on väiksed ja kandilisema kujuga, kartulitärklise terad suuremad ning ovaalsed
7