Biokeemia labori protokoll - Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega (0)

Tallinna Tehnikaülikool
1. Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega

Biokeemia labori protokoll

2011

1.1 Valkude reaktsioonid

Töö teoreetilised alused

Valgud koosnevad aminohapetest, mis on omavahel seotud peptiidsidemetega. Peptiidside moodustub kui ühe aminohappe karbosküülrühm reageerib teise aminohappe aminorühmaga. Valkude koostises on 20 üldlevinud aminohapet, neid nimetatakse proteogeenseteks. Lisaks üldlevinud aminohapete sisaldavad mõned valgud ka nn ebaharilikke aminohappeid .
Valgud on biopolümeerid ja täidavad oma funktsioone tänu oma iseloomulikele ruumilistele struktuuridele. Esineb primaarne, sekundaarne ja tertsiaarne struktuur.
Kui valgumolekul koosneb mitmest polüpeptiidahelast, siis on valk oligomeerne ja osamolekulide omavahelist seostumist iseloomustab kvaternaarne struktuur.
Denaturatsioon on valgu ruumilise struktuuri lagunemine . Denaturatsiooni käigus katkevad või paigutuvad ümber ruumilist struktuuri hoidvad nõrgad sidemed, aga peptiidsidemed säiluvad.
Kui laguneb aga ka peptiidside, siis on tegemist valgu hüdrolüüsiga.
Valkude kindlakstegemiseks kasutatakse kvalitatiivse analüüsi meetodeid, nagu nt värvus-reaktsioonid, väljasadestamine ja väljasoolastamine.
Värvusreaktsioonidega tehakse kindlaks peptiidsidemete olemasolu või teatavad aminohapped.
Väljasadestamisega uuritakse denaturatsiooniprotsesse või eraldatakse valke madalama molekulmassiga peptiididest ning väljasoolastamist kasutatakse erinevate valgufraktsioonide lahutamiseks.
Kvalitatiivsed reaktsioonid jagatakse kaheks: universaalsed (nt biureedireaktsioon )ja spetsiifilised reaktsioonid (nt Milloni reaktsioon ).
Universaalsed reaktsioonid toimuvad kõikidega valkudega ning spetsiifilised reaktsioonid toimuvad ainult kindlaid aminohappeid sisaldavate valkudega.

1.1.1 Biureedireaktsioon

Biureedireaktsioon on valkude üldreaktsioon. Ühendid, mis sisaldavad rohkem kui kahte peptiidsidet, annavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi.
Aluselises keskkonnas annavad Cu(II)- ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüsi produktidega) roosaka värvusega biureetkompleksi.
Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja Cu2+-ioonide hulgast lahuses.
Katse käik: Valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust. Lisasin sama palju 10%-list NaOH lahust ning paar tilka 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin ning soojendasin katseklaasi.
Tulemus: Lahus värvus violetseks.
Järeldused: Lahuses esinesid valgumolekulid (ühend, mis sisaldab kaht või enamat peptiidsidet), sest moodustub violetne biureetkompleks.

1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon)

Mulderi reaktsiooniga saab tõestada aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus. Kontsentreeritud HNO3 lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja sadestub lahusest välja. Soojendamisel aromaatsed tuumad nitreeruvad. Moodustub kollane nitrofenooli ühend, mis leeliselises keskkonnas värvub oranžiks.
Töö käik: 1 ml munavalgu lahusele lisasin 6 tilka konts. HNO3, loksutasin (tekkis valge sade)ning seejärel soojendasin kuni kollase sademe tekkimiseni. Jahutasin segu, siis lisasin NH4OH lahust ja loksutasin.
Tulemus: Lämmastikhappe lisamisel tekkis valge sade, soojendamisel helekollane sade ning NH4OH lisamisel intensiivse oranži värvusega sade.
Järeldus: Helekollase sademe teke näitab aromaatsete tuumade nitreerumist, on tekkinud nitrofenooli tüüpi ühend. Leeliselises keskkonnas on see oranž. Võime järeldada, et munavalgu lahus sisaldas aromaatseid tuumi sisaldavaid aminohappeid.

1.1.3 Milloni reaktsioon

Milloni reaktiiv on elavhõbe(II) nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, valkude puhul türosiini radikaalid. Türosiini olemasolul valgu koostises värvub valgu lahus või sade roosakaks kuni punaseks.
Töö käik: Ühte katseklaasi valasin 1 ml munavalgu lahust ja teise 1 ml želatiini lahust. Lisasin mõlemasse 6 tilka Milloni reaktiivi ning soojendasin segusid vesivannis.
Tulemus: Milloni reaktiivi lisamisel tekkis munavalgulahuses sade, želatiinilahuses mitte. Soojendamisel värvus munavalgu lahuses olev sade roosakaks, želatiinilahusega ei toimunud muutuseid.
Järeldus: Munavalgu lahus denatureerub ning sisaldab fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavat ühendit, antud juhul türosiini. Želatiinilahus türosiini ei sisalda.

1.1.4 Sulfhüdrüüli- ehk tioolireaktsioon

Positiivne tioolireaktsioon näitab tsüsteiini olemasolu valgus. Leeliselisele hüdrolüüsile alluv tioolrühm annab sulfiidioone, mis Pb2+ juuresolekul moodustavad PbS sademe (must/ tumepruun ). Pliiatsetaadi lahus moodustab aluselises keskkonnas naatriumplumbaadi (II), mis annabki sulfiidioonidega PbS sademe.
Katse käik: Lisasin 2 ml-le Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele tilgutades 10%-list NaOH lahust kuni kadus tekkiv Pb(OH)2 sade ning lahuses moodustus naatriumplumbaat Na2PbO2. Seejärel lisasin 1 ml munavalgu lahust, loksutasin ning soojendasin reaktsioonisegu.
Tulemus: Reaktsioonisegu soojendamisel tekkis pruunikas sade, mis formeerus edasi ka statiivil.
Järeldus: Pruunika sademe (PbS sade) teke näitab, et munavalgu lahuses esineb tsüsteiini.

1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega

Trikloroäädikhape denatureerib valke ning sadestab neid lahusest välja, samas ei sadesta trikloroäädikhape peptiide, mille molekulmass on alla 10000. Trikloroäädikhapet saab kasutada valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikuühenditest, nagu seda on näiteks valgu hüdrolüüsi produktid .
Töö käik: Valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust ning lisasin sinna ka mõne tilka CCl3COOH lahust, seejärel loksutasin lahust.
Tulemus: Tekib valge sade.
Järeldus: Munavalgu lahus sisaldab valku, mille molekulmass on üle 10000.

1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)

Väljasoolastamine kujutab endast protsessi, kus kõrgetel kontsentratsioonidel olevad neutraalsed soolad (nt. (NH4) 2SO4 ) põhjustavad valkude denaturatsiooni ja nende väljasadestumist lahusest, kusjuures sadestumise protsess on sõltuv valgu hüdrofiilsusest/hüdrofoobsusest, laengust, molekulmassist jm omadustest. Globuliinid sadestuvad (NH4)2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinid aga küllastunud lahuses.
Töö käik: Lisasin 2 ml munavalgu lahusele sama palju (NH4)2SO4 küllastunud lahust, loksutasin ning jätsin mõneks ajaks seisma. Eraldasin tekkinud globuliinide sademe filtrimise teel. Lisasin saadud filtraadile väikeste protsjonitena kristalset (NH4)2SO4 kuni küllastuskontsentratsioonini ehk hetkeni kui soola kristallid enam ei lahustunud.
Tulemus: (NH4)2SO4 küllastunud lahuse lisamisel muutus lahus häguseks. Kristalse (NH4)2SO4 lisamisel tekkis rohkem sadet.
Järeldus: Valgu lahuses oli nii globuliine kui ka albumiine, aga albumiine oli lahuses rohkem.

1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st

Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril, kusjuures denatureerumise temperatuur sõltub valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Denatureerumine toob enamasti kaasa valgu väljasadestumise lahusest. Väljasadestumist ei toimu, kui keskkonna pH on palju erinev valgu isoelektrilise täpi väärtusest.
Valgu isoelektriline täpp näitab keskkonna pH väärtust, mille juures on valgumolekuli suumaarne laeng 0.
Töö käik: Valasin kahte katseklaasi 2 ml munavalgu lahust. Ühele lisasin 1 ml kontsentreeritud äädikhapet, teise jätsin ainult munavalgu lahuse. Kuumutasin mõlemaid katseklaase.
Tulemus: Katseklaasis, kus oli munavalgu ja etaanhappe segu ei toimunud muutusi. Ainult munavalgu lahusega katseklaasi sisu hägustus, formeerus hele sade.
Järeldus: Happe lisamine põhjustas pH muutuse, mistõttu kõik valgumolekulid omandasid ühesuguse laengu ning valgu väljasadestumist lahusest ei toimunud. Hapestamata munavalgu lahus denatureerus kuumutamisel pöördumatult ning toimus väljasadestumine lahusest.

1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega

Veega segunevad orgaanilised solvendid (nt etanool, atsetoon ) kutsuvad valgumolekulis esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Valk dehüdratiseerub ning sadestub lahusest välja. Ettevaatlikult solventi lisades ning katseklaasi sisu pidevalt loksutades denatureerub valk pöörduvalt.
Töö käik: Valasin katseklaasi 2 ml munavalgu lahust. Tilgutasin lahusele etanooli kuni lahus läks häguseks. Lahjendasin katseklaasi sisu veega.
Tulemus: Veega lahjendamisel tekkinud sade lahustus uuesti.
Järeldus: Toimus valgu pöörduv denaturatsioon.

1.2 Süsivesikute reaktsioonid

Töö teoreetilised alused

Süsivesikud koosnevad ainult süsinikust, vesinikust ja hapnikust. Struktuurist sõltuvalt jaotatakse nad mono -, oligo - ja polüsahhariidideks.
Monosahhariidid ehk monoosid on lihtsuhkrud, mis omavad energeetilist rolli ning on oligo- ja polüsahhariidide ehituskivideks. Kõik monoosid on redutseerumisvõimelised.
Oligosahhariidid koosnevad 2-10 monosahhariidi molekuli jäägist, nt sahharoos , laktoos, maltoos jt. Oligosahhariidid jagunevad redutseerivateks ja mitteredutseerivateks.
Polüsahhariidides on kuni tuhandeid lihtsuhkru jääke, nt tärklis, glükogeen jt.
Oligo- ja polüsahhariidides on monomeerid seotud O-glükosiidsidemega.
Süsivesikute kvalitatiivseks määramiseks kasutatavad reaktsioonid põhinevad karbonüülrühma esinemisel (nt hõbepeegli reaktsioon, reaktsioon Fehlingi lahustega jt). Veel on süsivesikud võimalik määrata heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali (pentooside) või 5-hüdroksümetüülfurfuraali (heksooside) moodustumisega süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul. Mõlemad aldehüüdid moodustavad kondenseerumisel fenoolidega värvilisi ühendeid (Molisch’i test, Selivanoff 'i reaktsioon).

1.2.1 Molisch’i test

Molisch’i reaktiiv on α-naftooli segu alkoholis.
Positiivse Molisch’i testi annavad nii mono-, oligo- kui ka polüsahhariidid. Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad, moodustuvad fufuraalid või 5-hüdroksümetüülfurfuraalid. Need produktid reageerivad α-naftooliga ning moodustub lillakas kiht uuritava lahuse ja happe piirpinnale.
Töö käik: Valasin ühte katseklaasi 2 ml fruktoosi lahust ja teise katseklaasi 2 ml sahharoosi lahust. Lisasin mõlemale lahusele mõned tilgad Molisch’i reaktiivi, loksutasin. Lisasin mõlemale lahusele 1 ml kontsentreetitud H2SO4 nii et hape voolas mööda katseklaasi külge uuritava lahuse alla.
Tulemus: Mõlemas katseklaasis moodustus purpurne kiht happe ja lahuse piirpinnal , kusjuures värvuse intensiivsus erines. Fruktoosi lahuses tekkinud kiht oli tumedam lilla kui sahharoosi ja happe piirpinnal olev kiht.
Järeldus: Nii fruktoosis kui ka sahharoosis esinevad süsivesikud.

1.2.2 Osasoonide saamine

Osasoonid on süsivesikute derivaadid, mis tekivad redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Osasoone moodustavad seega lisaks monoosidele ka taandavad oligosahhariidid. Osasoone saab eristada kristallide kuju järgi.
Osasoonide moodustumine on kaheetapiline. Kõigepealt toimub reaktsioon C-1 paikneva aldehüüdrühma kaudu, formeerub hüdrasoon C-1 positsioonis. Seejärel oksüdeerub C-2 asendis olev hüdroksüülrühm karbonüüliks ja formeerub hüdrasoon C-2 asendis. Reaktsiooniks on vaja fenüülhüdrasiini liiga ja pikka kuumutamist.
Töö käik: Valasin ühte katseklaasi 2 ml glükoosi lahust ja teise katseklaasi 2 ml arabinoosi lahust, mis on mõlemad taandavad suhkrud. Mõlemale lahusele lisasin 0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati. Loksutasin lahustumiseni. Hoidsin mõlemaid reaktsioonisegusid umbkaudu 40 minutit tulises veevannis kuni hakkasid moodustuma kristallid. Seejärel jahutasin veevannis ning osasoonide kristallide kuju tehti kindlaks mikroskoobis.
Tulemus: Nii arabinoosi kui ka glükoosi lahuses hakkasid pikaajalise kuumutamise tagajärjel moodustuma kristallid, kusjuures glükoosi lahuses moodustusid kristallid palju kiiremini kui arabinoosi lahuses.
Osasooni kristallide kuju:
Pilt 1. Glükoosi osasoonid Pilt 2. Arabinoosi osasoonid

1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon

Taandavate suhkrud sisaldavad aldehüüdrühma, mis taandab mitmete metallide sooli. Aammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest sadestub metalliline hõbe välja, moodustades katseklaasi pinnale hõbepeegli.
Töö käik: Valasin puhtasse katseklaasi 1 ml 1%-list AgNO3 lahust, millele lisasin 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust ja loksutasin. Lisasin segule 1 ml glükoosi lahust, loksutasin ja soojendasin.
Tulemus: Katseklaasi seintele tekkis soojendamise käigus ilus hõbedane peeglikiht, mille formeerumine jätkus mõnda aega ka pärast lahuse vesivannist väljavõtmist. Mõne aja pärast hõbeda kiht hakkas tuhmuma ja kadus uuesti.
Järeldus: Taandunud hõbeda sadenemine näitab, et glükoosi molekulides sisaldub aldehüüdrühm, mille toimel sadestub ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest metalliline hõbe välja.

1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega

Fehlingi reaktiivi ehk leeliselist vask(II) tartraatkompleksi, mis saadakse Fehlingi I ja Fehlingi II lahuse kokkusegamisel, kasutatakse taandavate suhkrute määramiseks.
Tekib vask(II)-tartaatkompleks, mis reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba aldehüüd- või ketorühma toimel vask taansub ja tekib vask(I)oksiid, mis on punase värvusega ja sadeneb lahusest välja.
Sahharoos ei reageeri Fehlingi reaktiiviga, kuna ta pole taandav suhkur, küll aga reageerivad sahharoosi hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos .
Sahharoosi hüdrolüüsi nimetatakse inversiooniks ja glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset segu nimetatakse invertsuhkruks.
Töö käik: Valasin kahte katseklaasi kummasegi 1 ml sahharoosi lahust. Ühte katseklaasi lisasin 1 tilga kontsentreeritud HCl. Loksutasin ja hoidsin mõlemat lahust kuumas veevannis. Seejärel lisasin mõlemasse lahusesse 1 ml Fehlingi I (CuSO4 vesilahus ) ja 1 ml Fehlingi II lahust ( leeliseline K,Na-tartraadi e Seignett'i soola vesilahus )ning loksutasin. Lahused värvusid siniseks. Soojendasin segusid uuesti.
Tulemus: Fehlingi I ja Fehlingi II lahuse lisamisel muutusid mõlemad lahused siniseks, kusjuures hapestatud sahharoosi lahuse värvus oli pisut rohekam. Pärast teistkordset kuumutamist, tekkis hapestatud fruktoosi lahuses punane sade.
Järeldus: Kontsentreeritud HCl lisamine kiirendas sahharoosi hüdrolüüsi tunduvalt, mistõttu tekkisid katseklaasis sahharoosi hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos ning Fehlingi reaktsioon andis taandavate suhkrute suhtes positiivse tulemuse. Teises katseklaasis sahharoosi hüdrolüüsi ei toimunud ning Fehlingi reaktsioon positiivset tulemust anda ei saanud.

1.2.5 Barfoed’ reaktsioon

Barfoed’ reaktiiv kujutab endast vask(II)atsetaadi Cu(CH3COO)2 lahust äädikhappes.
Barfoed’ reaktiiviga saab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest. Nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske ainult monosahhariidid. Reaktsioon annab punase vask(I)oksiidi sademe.
RCOH + 2Cu2+ + 2H2O → RCOOH + Cu2O + 4H+
Katse käik: Valasin ühte katseklaasi 1 ml glükoosi lahust ja teise katseklaasi 1 ml maltoosi lahust. Mõlemale lahusele lisasin 3 ml Barfoed’ reaktiivi, segasin ning kuumutasin ca 5 minutit.
Tulemus: Kuumutamise käigus tekkis glükoosi lahust sisaldavas katseklaasis tekkis punakas sade (Cu2O), maltoosi lahust sisaldavas katseklaasis sadet ei tekkinud.
Järeldus: Glükoos on monosahhariid ja taandab vaske, andes punaka sademe. Maltoos on oligosahhariid ja Barfoed’ reaktiiviga positiivset reaktsiooni ei anna; ei taanda vaske ja sadet ei teki.

1.2.6 Selivanoff’i reaktsioon

Kui suhkruid kuumutada mineraalhapete juuresolekul, siis moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfuraal ja heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal.
Need ühendid reageerivad fenoolidega ja tulemuseks on värvilised saadused.
Selivanoff’i reaktiiv koosneb soolhappest, resortsinoolist ja FeCl3-st. Selivanoff’i reaktsioon annab punakaspruuni kuni tumepruuni ühendi.
Töö käik: Valasin ühte katseklaasi 1 ml fruktoosi lahust ja teise 1 ml glükoosi lahust. Lisasin neile 2 ml Selivanoff’i reaktiivi, loksutasin ja soojendasin mõned minutid .
Tulemus: Fruktoosi lahus värvus punaseks juba mõne minutiga, glükoosi lahusega muutusi ei täheldanud.
Järeldus: Fruktoos on ketoos , kuna Selivanoff’i reaktsioon toimub ketoosidega kiiremini ning glükoos on aldoos, sest reaktsioon toimus aeglasemalt. Pikemaajalisemal kuumutamisel tekiks värviline ühend ka glükoosi ja Selivanoff’i reaktiivi segusse .

1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga

Tärklis moodustab joodiga lillakas-siniseid komplekse, sest polüsahhariidi ahelad keeruvad joodi molekulide ümber. Kompleks laguneb kõrgel temperatuuril ja kaotab oma värvuse, kuid jahtudes jällegi taastab selle (pöörduv reaktsioon).
Joodiga värvuvad ka taimsest materjalist eraldatud tärkliseterakesed ning neid saab mikroskoobis vaadelda, et teha kindlaks nende päritolu.
Töö käik: Valasin katseklaasi 5 ml tärkliselahust ja lisasin 1 ml joodilahust. Loksutasin ja kuumutasin keemiseni. Jahutasin katseklaasi alumise poole veejoa all maha.
Tulemus: Kuumutamisel muutus lahuse värvus heledamaks (helelillaks), kuid päris ära värvus siiski ei kadunud. Veejoa all jahutades taastus intensiivne lilla värvus.
Järeldus: Tekkinud tärklise ja joodi sinine kompleks lagunes kõrgemal temperatuuril. Tegemist on pöörduva reaktsiooniga. Pilt 4. Kartulitärklise terad
Pilt 3. Maisitärklise terad