Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Keemia instituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia praktikumi laboratoorne töö
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Üliõpilane: Liis Hendrikson
Matrikli nr: 104191
Õpperühm: KATB 41
Juhendaja : Tiina Randla
3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Töö teoreetilised alused:
Invertaas ehk -fruktofuranosidaas on enüüsm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsideme hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavd fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:
β-D-fruktofuranosiid + H2O → β, D- fruktoos + mono - või oligosahhariid
Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed ja mesilased . Inimese jaoks on invertaas oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile:
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi a fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks viiakse kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov , mis sisaldab taandavaid suhkruid, komplekslahusesse (triloon B). Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.
Keetmisel toimub reaktsioon :
Reaktsioonil vabanenud triloon B kogust määratakse tiitrimise teel, kasutades selleks 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimist võib täheldada lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Tiitrimisel:
Tiitrimiseks kulunud
lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse
vedela ensüümipreparaadi korral ja
tahke ensüümipreparaadi korral.
1 mikrokatal – ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekudi jooksul
juures produtseeritakse 1 mikromool produkti .
Töö käik:
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine.

• Doseerisin ensüümipreparaati sobiva automaatpipeti abil ja viisin otse lahuse valmistamiseks ettenähtud gradueeritud katseklaasi, kuhu lisasin sobiva lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit.
  

Katseklaasi lisasin 0,5 ml invertiini lahust ja 9,5 ml atsetaati, et saavutada 20 kordne lahjendus.

• Katseklaasi sulgesin korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks.
  

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine.

• Võtsin 50 ml mahuga katseklaas , kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8.
  
• Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin umbes 5 – 10 minutiks vesitermostaati juurde soojenema.
  
• Võtsin 3 koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust.
  

Komplekslahus oli erksinine.

• 5 – 10 minuti pärast, kui substraat oli termostaadis saavutanus temperatuuri , lisasin sellele 0,5 ml uuritavat invertaasi töölahust.
  
• Lahuse loksutasin läbi.
  
• Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus.
  

See oli niinimetatud 0-proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel.

• Katseklaasi asetasin kiiresti tagasi termostaati ja samal ajal fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse aja kella järgi.
  
• 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi.
  
• 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi.
  
• Eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist.
  

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine.

• Kolvid, mis sisaldasid lisaks komplekslahusele ka erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, asetasin elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema.
  

Aega hakkasin arvestama alates keemise algusest.

• 10 minuti pärast lõpetasin keetmise ning valasin 150 ml destilleeritud vett kolbi läbi püstjahuti.
  
• Kolvi võtsin pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.
  
• Kõikidesse kolbidesse lisasin indikaatorina 0,3 ml ehk 5 tilka mureksiidi vesilahust.
  

Kolvis olevad lahused muutusid rohkemal või vähemal määral violetseks.

• Kolbides olevad lahused tiitrisin 0,02 M lahusega kuni violetne värvus asendus selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega.
  

Tiitrimise käigus loksutasin kolvi sisu pidevalt.

• Tiitrimiseks kulunud 0,02 M lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku (sirge) järgi taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis.
  

Tiitrimisel kulunud 0,02 M
lahuse hulgad:
Taandavate suhkrute sisaldused kaliibrimisgraafikult:
Tulemused ja nende interpreteerimine:
Invertaasi preparaadi aktiivsus (A)
arvutatakse valemi järgi:
Kus: taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis,
taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis,
reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht,
ensüümi töölahuse üldmaht,
tegur üleminekuks mikrogrammidele
hüdrolüüsi kestvus,
glükoosi molekulmass
proovi maht taandavate suhkrute määramiseks,
ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht,
ensüümipreparaadi kaalutis ,
Vedela invertaasi preparaadi uurimisel avaldatakse aktiivsus ensüümipreparaadi 1 ml kohta . Arvutus viiakse läbi vastavalt valemile:
Kus: lahjendusmäär, mida kasutati vedelast ensüümipreparaadist töölahuse valmistamisel.
Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena.
Kahe saadud tulemuse
ja
erinevus protsentides:
Järeldused:
Kui töö on läbi viidud korrektselt, peaksin tulemused kokku langema või erinema teineteisest maksimaalselt 20% võrra.
Keskmine invertaasi preparaadi invertiini lahuse aktiivsus oli katse tulemusena . See näitab, et 1 sekundi jooksul
juures produtseeritakse 64,825 mikromooli produkti (sahharoosi).
Üksikud katse tulemused erinesid teineteisest vaid 0,37%, mille järgi võib öelda, et katse oli sooritatud üsna täpselt.