Biokeemia protokoll - Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega (0)

Töö teoreetilised alused
Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega
Kvalitatiivsete reaktsioonide abil saab kindlaks teha mingi keemilise elemendi, funktionaalse rühma, ühendi või ühendite rühma olemasolu uuritavas materjalis . Hinnatakse iseloomuliku värvuse, sademe või hägu teket, gaasi eraldumist, teisi silmaga nähtavaid muutuseid. Kvalitatiivsete reaktsioonide puhul ei mõõdeta uuritava komponendi sisaldust uuritavas materjalis, seega ei ole vaja reagentidega väga täpselt doseerida .
Valkude reaktsioonid
Valgud on polüpeptiidid, mis koosnevad omavahel ühendatud aminohapetest. Aminohapped on ühendatud omavahel peptiidsidemega, mis moodustub ühe aminohappe karboksüülrühma reageerimisel teise aminohappe aminorühmaga. Sideme moodustamisel eraldub vesi, seega on tegemist kondensatsioonireaktsiooniga.
Valkude koostises leidub 20 üldlevinud aminohapet. Mõned valgud sisaldavad ka nn ebaharilikke aminohappeid , nt aminohapete hädroksü-, metüül-, fosfüül- jne derivaadid . Mõndasid aminohappeid ja nende derivaate ei leidu valkudes, aga need täidavad tähtsaid füsioloogilisi funktsioone.
Valkudel on 4 erinevat struktuurset astet. Primaarstruktuurist tulenevad valkude ruumilised struktuurid. Sekundaarstruktuur on moodustunud H-sidemete abil, mis tekivad peptiidsidemete struktuuri kuuluvate amiidrühma vesiniku ja karbonüülrühma hapniku vahele. Tertsiaarstrukruur on peptiidahela ruumiline pakkimine. Kvaternaarstruktuur moodustub mitmeahelaliste polüpeptiidsete valkude ehk oligomeeride omavahelisest asetusest, mis on seotud nõrkade jõududega.
Denaturatsioon on valgu ruumilise struktuuri lagunemine , mille käigus katkevad või grupeeruvad ümber struktuuri fikseeerivad nõrgad sidemed, kuid säiluvad peptiidsidemed. Denatureerimise tõttu võib valk välja sadestuda.
Valkude kindlakstegemiseks lahustes kasutatakse erinevaid kvalitatiivse analüüsi meetodeid nagu värvusreaktsioonid (vaadeldakse lahuse värvust), väljasadestamine (uuritakse denaturatsiooni ), väljasoolastamine (uuritakse valkude lahustumist).
Kvalitatiivsed reaktsioonid jagunevad universaalseteks, mis on omased kõikidele valkudele ja spetsiifilisteks, mis on omased ainult kindlaid aminohappeid sisaldavatele valkudele.
1. Biureedireaktsioon
Biureedireaktsioon on valkude üldreaktsioon, kuna kaht või enamat peptiidsidet sisaldavad ühendid moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi. Lühikese ahelaga peptiididega (valgu hürdolüüsi produktidega) moodustavad Cu2+- ioonid roosa värvusega biureetkompleksi.
Töö käik: valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja ühe tilga 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin katseklaasi sisu. Reaktsioonisegu muutus lillaks.
Järeldus: lahuses olid peptiidsidemed, kuna need moodustasid aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse biureetkompleksi.
2. Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon )
Mulderi reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) sisaldumist valgus. Konsentreeritud HNO3 lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja seadestub. Katseklaasi soojendamisel aromaatsed tuumad nitreeruvad ja moodustub intensiivse kollase värvusega ühend, mis omandab leeliselises keskkonnas oranži värvuse.
Töö käik: valasin katseklaasin 1 ml munavalgulahust, lisasin 5 tilka konsentreeritud HNO3-e. Loksutasin reaktsioonisegu ja soojendasin, kuni tekkinuda valge sade värvus kollaseks. Jahutasin segu, lisasin NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni ja loksutasin katseklaasi. Lahus muutus oranžikaks.
Järeldus: reaktsioonisegu sisaldas aromaatsete tuumadega aminohappeid, kuna HNO3 lisamisel aromaatsed tuumad nitreerusid ning tekkis kollane sade. Leeliselises keskkonnas muutus lahus oranžiks.
3. Milloni reaktsioon
Milloni reaktiiv on elavhõbe(II) nitraadi lahus lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiin. Türosiin sisaldub enamikus valkudes, seega annab reaktsioon enamasti positiivse tulemuse, mille puhul valgu lahus või denatureerunud sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)punaseks.
Töö käik: valasin ühte katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml želatiini lahust, mõlemasse katseklaasi lisasin 5 tilka Milloni reaktiivi, kuumutasin. Munavalgelahusesse tekkis õrnalt roosa sademekiht, želatiinilahus jäi endiseks, ühtki muutust ei toimunud.
Järeldus: munavalgulahuses leidus türosiini radikaale, kuna tekkis õrnalt roosa sade, želatiinilahuses türosiini radikaale ei esinenud , kuna lahuses ei toimunud muutusi.
4. Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
Positiivne reaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) esinemist valgus. Tsüsteiini tioolrühm allub leeliselisele hüdrolüüsile andes sulfiidioone, millest moodustub Pb2+-ioonide juuresolekul ülipeen must või tumepruun pliisulfiidi sade. Katse sooritatakse pliiatsetaadi lahusega, mis moodustab aluselises keskkonnas naatriumplumbaadi(II). Viimane annab lahusest vabanenud sulfiidioonidega PbS, mis sadestub aeglaselt välja.
Töö käik: lisasin 2 ml Pb(CH3COO)2 0,5%-lisele lahusele tilgakaupa 10%-list NaOH lahust, kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kadus ja moodustus Na2PbO2. Lisasin katseseklaasi 1 ml munavalgu lahust, loksutasin, soojendasin reaktsioonisegu, kuni hakkas moodustuma tume sade. Asetasin katseklaasi statiivi ja jäin ootama sademe formeerumist.
Järeldus: tekkis tumepruun peenike sade, seega leidus munavalgus tsüsteiini.
5. Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape (TKÄ) on levinud valke denatureeriv ja lahusest väljasadestav reagent . TKÄ ei sadesta peptiide, mille molekulmass on alla 10 000.
Töö käik: valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisasin paar tilka CCI3COOH lahust. Loksutasin ning tekkis hägu.
Järeldus: kuna tekkis hägu, siis oli munavalgu lahuse molekulmass oli üle 10 000.
6. Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsete soolade [(NH4) 2SO4 , MgSO4, NaCl jt] kõrged konsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni ja nende väljasadestumine lahusest, mida nimetatakse väljasoolastamiseks. Sadestumist mõjutavad hüdrofiilsus/hüdrofoobsus, laeng, molekulmass jt omadused. Globuliinid sadestuvad (NH4)2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinid küllastunud lahuses.
Töö käik: lisasin 2 ml munavalgu lahusele võrdse mahu (NH4)2SO4 küllastunud lahust, loksutasin, jätsin viieks minutiks seisma. Eraldasin tekkinud globuliinide sademe filtrimise teel. Filtraadile lisasin kristalset (NH4)2SO4 kuni kristallid enam ei lahustu. Jälgisin albumiinide sademe moodustumist. Võrdlemisel segus, et globuliitset sadet tekkis rohkem.
Järeldus: lahus sisaldas globuliine ja albumiine, kuna mõlemad sadestusid lahusest välja. Rohkem tekkis globuliinset sadet, seega oli globuliinide sisaldus lahuses suurem kui albumiinide oma.
7. Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril, kuna ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed katkevad. Kui keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pl) väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja sadestuda. Valgu pl näitab keskkonna pH väärtust, mille juures on valgumolekulis positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne, summaarne laeng võrdub nulliga. Selle tulemusena valgud sadestuvad. Pl-st oluliselt erineva pH väärtusega keskkonnas omandavad kõik valgumolekulid ühesuguse laengu ja väljasadestumist ei toimu.
Töö käik: valasin kahte katseklaasi kummassegi 2 ml munavalgu lahust. Ühte lisasin 1 ml konsentreeritud äädikhapet. Kuumutasin katseklaase kuumal veevannil. Katseklaasis, kus oli ainult munavalk, tekkis väga õrn hägu, teises katseklaasis muutusi ei toimunud.
Järeldus: äädikhape muutis keskkonna pH väärtust, seega omandasid valgumolekulid ühesuguse laengu ja valgu väljasadestumist ei toimunud.
Kirjanduse järgi on munavalgu isoelektriliseks täpiks 4,6, järelikult muutis äädikhappe lisamine keskkonna pH happelisemaks ja väljasadestumist ei toimunud.
8. Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Etanool, atsetoon jt veega segunevad orgaanilised lahustid kutsuvad esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumist molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, valk sadeneb lahusest välja. Kui sadestit ettevaatilkult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada , denatureerub valk pöörduvalt. Kui sadesti konsentratsiooni vee lisamise teel vähendada, siis lahustub tekkinud sade uuesti. Orgaanilise solvendi liiga kiire või suures koguses lisamine toob kaasa valgu pöördumatu denaturatsiooni.
Töö käik: valasin katseklaasi 2 ml munavalgu lahust, lisasin tilkhaaval ja loksutades orgaanilist solventi kuni lahuse hägustumiseni. Lisasin destilleeritud vett, mille toimel hägu ei lahustunud.
Järeldus: tegu oli pöördumatu denaturatsiooniga, kuna sadesti konsentratsiooni vähendamisel sade ei lahustunud.
Süsivesikute reaktsioonid
Süsivesinikud on bioloogiliset ühendite rühm, mis koosneb süsinikust, vesinikust ja hapnikust. Strukuuri järgi jaotatakse neid mono -, oligo - ja polüsahhariidideks. Monosahhariidide ehk monooside ülesandeks on energia andmine, lisaks kuuluvad nad koeensüümide ja nukleiinhapete koostisesse, on oligo- ja polüsahhariidide „ehituskivideks“. Monosahhariidide üldvalem on Cx(H2O)y. Nad erinevad üksteisest ruumilise struktuuri poolest, mis mõjutab nende omadusi. Monoosid on reageerimisvõimelised tänu aldehüüd- või ketorühma esinemisele.
Oligaosahhariidide molekulid koosnevad 2-10 monosahhariidi molekuli jäägist. Oligosahhariidid jaotatakse redutseerivateks ja mitteredutseerivateks. Oligosahhariidid täidavad energeetilist rolli, nad kuuluvad glükolipiidide koosseisu, osalevad rakk - rakk äratundmises.
Polüsahhaariidid ehk polüoosid koosnevad tuhandetest lihtsuhkru molekulidest, mis on ühinenud pikkadeks sirgeteks või hargnenud struktuuriga ahelateks. Polüsahhariidid on energeetiliseks varuaineks, taimedes rakukesta ehitusmatejaliks ( tselluloos , pektiin).
Enamik süsivesikute määramise kvalitatiivseid reaktsioone põhineb karbonüülrühma esinemisel molekulis. Sõltuvalt reaktsioonitingimustest oksüdeeruvad suhkrud erinevateks produktideks. Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud metallide ioone ja teisi oksüdeerijaid, mille käigus süsinikuahel lahuneb ja tekib oksüdatsiooniproduktide segu. Neutraalses või happelises keskkonnas on produktideks erinevad happed (aldoonhape, uroonhape).
Teine osa analüüsi meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide moodustamisele süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul moodustades värvilisi ühendeid.
1. Molisch’i test
Tegu on süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitestiga, kuna positiivse reaktsiooni annavad nii mono-, oligo- ja polüsahhariidid. Ka nukleiinhapped ja glükoproteiinid annavad positiivse reaktsiooni, kuna tugevas happelises keskkonnas toimub monosahhariidide vabanemine . Väävelhappe toimel moodustavad suhkrud furfuraale või 5-hüdroksümetüülfurfaale, mis reageerivad edasi α-naftooliga, moodustades purpurse kihi uuritava lahuse ja happe piirpinnale.
Töö käik: võtsin kaks katseklaasi, valasin ühte 2 ml glükoosi, teise 2 ml laktoosi lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin 5 tilka Molisch’i reaktiivi. Loksutasin katseklaase. Hoidsin katseklaase kaldasendis ja lisasin ettevaatlikult 1 ml konsentreeritud väävelhapet. Hape voolas mööda katseklaasi külge uuritava lahuse alla. Mõlemas katseklaasis tekkis uuritava lahuse ja happe piirpinnale tekib tumelilla sademeliht.
Järeldus: katse kinnitas, et glükoos ja laktoos on süsivesikud, kuna uuritava lahuse ja happe piirpinnale tekkis lilla sade.
2. Osasoonide saamine
Osasoonid on süsivesikute derivaadid, mis tekivad redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Osasoone moodustavad monoosid ja taandavad oligosahhariidid. Osasoonid kristalluvad lahusest välja, tekkivate kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud. Osasoonide moodustumise reaktsioon on kaheetapiline: esmalt toimub reaktsioon C-1 paikneva aldehüüdrühma kaudu ning formeerub hüdrasoon C-1 positsioonis. Teises etapis oksüdeerub C-2 asendis olev hüdroksüülrühm karbonüüliks ja selle kaudu formeerub hüdrasoon.
Töö käik: valasin ühte katseklaasi 2 ml glükoosi, teise 2 ml arabinoosi lahust. Lisasin mõlemasse ~0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja ~0,2 g kristallilist naatriumatsetaati, loksutasin, kuni tahked ained lahustusid. Hoidsin segusid 40 minutit keevas veevannis, loksutasin aeg-ajalt, seejärel jahutasin jäävannis. Katseklaasi moodustusid suhkrute kollased kristallid.
Järeldus: kuna osasoone moodustuvavad monoosid ja taandavad oligosahhariidid, siis kinnitas osasoonide moodustumine, et glükoos ja arabinoos kuuluvad glükooside ja taandavate oligosahhariidide hulka.
Fruktoos Glükoos Maltoos Laktoos
Kõige tihedamalt paiknesid koos laktoosi kristallid, mis koosnesid lühikestest üksteise kõrval asuvatest kristallidest. Kõige pikemad kristallid olid glükoosil, mis olid koondunud puntidesse. Fruktoosi kristallid paiknesid üsna hõredalt puntides. Maltoosi kristallid olid erineva pikkusega ning paiknesid preparaadiklaasil laiali.
Kirjanduses toodud suhkrute kristallidest erines tunduvalt maltoos, mille lühikesed kristallikesed peaksid koonduma liblikakujulistesse kompleksidesse.
3. Hõbepeegli reaktsioon
Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest sadestub metalline hõbe aldehüüdide toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Reaktsioon toimub taandavate suhkrutega. Sadestamiseks kasutatakse Tolleni reaktiivi, mille aktiivseks komponendiks on AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv diammiinhõbe(I).
Töö käik: valasin puhtasse katseklaasi 1 ml 1 %-list AgNO3 lahust, lisasin 0,5 ml konsentreeritud NH4OH lahust ja loksutasin. Lisasin 1 ml glükoosi lahust, loksutasin, soojendasin veevannis. Taandunud hõbe sadestus mingil määral katseklaasi seintele .
Järeldus: ilmselt liigutati katseklaasi veevannis, sest osa hõbedast oli seintelt maha kukkunud. Kuna aga natuke peeglit tekkis, siis võib öelda, et glükoos on aldehüüdrühma sisaldav taandav suhkur.

4. Sahharoosi hürdolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
Fehlingi reaktiiv on üks levinuim taandavate suhkrute määramise reaktiiv. See saadakse Fehlingi I lahuse (CuSO4 vesilahus ) ja Fehlingi II lahuse (leeliseline K, Na-tartraadi e Seignett’i soola vesilahus) kokkusegamisel. Tekkiv vask(II)-tartaatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba aldehüüd- või ketorühma toimel vask taandub, andes vask(I)oksiidi, mis sadestub lahusest punase sademena välja. Suhkur oksüdeerub reaktsiooni käigus vastavaks happeks . Sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga reageerivad tema hürdolüüsi produktid glükoos ja fruktoos.
Töö käik: valasin kahte katseklaasi 1 ml sahharoosi lahust, ühte lisasin 1 tilga konts HCl. Loksutasin, hoidsin mõelmat lahust 5 min veevannis 80...85°C juures. Lisasin mõlemasse 1 ml Fehlingi I ja 1 ml Fehlingi II lahust, loksutasin. Lahus omandas intensiivse sinise värvuse. Kuumutades tekkis katseklaasis, millele lisasin HCl-i, punane sade.
Järeldus: punane sade tekkis katseklaasi, kuhu oli lisatud HCl. Sellest võib järeldada, et katseklaasis, kuhu lisati HCl, toimus sahharoosi hüdrolüüs, teises katseklaasis seda ei toimunud.
Kirjanduse andmetel kiirendavad hüdrolüüsi happed, sealhulgas ka nõrgad. Seega toimub katseklaasis, kuhu lisasin HCl-i, glükosiidsidemete katkemine ning sademe teke.
5. Barfoed’ reaktsioon
Barfoed’ reaktiiv on vask(II) atsetaadi lahus äädikhappes. Sellega on võimalik eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske ainult monosahhariidid . Positiivne reaktsioon annab punase vask(I)oksiidi sademe.
Töö käik: valasin ühte katseklaasi 1 ml glükoos lahust, teise 1 ml laktoosi lahust. Lisasin mõlemasse 3 ml Barfoed’ reaktiivi, segasin, hoidsin kuumal veelvannil mõne minuti. Glükoosilahusesse tekkis punane sade.
Järeldus: monosahhariidi lahusesse tekkis punane sade, oligosahhariidi lahusesse mitte. Järelikult on tõestatud, et glükoos on monosahhariid ja laktoos oligosahhariid.
6. Selivanoff ’i reaktsioon
Suhkrute kuumutamisel moodustub tugevate mineraalhapete juuresolekul pentoosidest furfuraal, heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal. Tekkivad ühendid reageerivad fenoolidega, andes värvilisi produkte. Reaktiivina kasutatakse Selivanoff’i reaktiivi, mis sisaldab HCl-i, benseen -1,3-diooli ja FeCl3. Reaktsiooni tulemusena tekib ühend, mille värvus varieerub punakaspruunist tumepunaseni. Reaktsioon toimub ketoosidega kiiremini kui aldoosidega.
Töö käik: valasin ühte katseklaasi 1 ml fruktoosi lahust, teise 1 ml glükoosi lahust. Lisasin mõlemasse 2 ml Selivanoff’i reaktiivi, loksutasin, soojendasin 5 minutit keeval veevannil. Fruktoosi lahuses tekkis punakaspruun värvus kiiremini ja oli intensiivsem.
Järeldus: kuna fruktoosi lahuses tekkis punakaspruun värvus enne, siis võib öelda, et fruktoosil on ketorühm, glükoosil aldehüüdrühm.
7. Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklis moodustab joodiga lillakas-siniseid komplekse, kuna polüsahhariidi ahelad keerduvad joodi molekulide ümber. Tekkinud kompleks laguneb kõrgel temperatuuril ja kaotab värvuse.
Töö käik: valasin katseklaasi ~ 4 ml tärkliselahust, lisasin 1 tilga joodilahust. Loksutasin ja kuumutasin keemiseni, lahus kaotas värvuse. Jahutasin katseklaasi jäävee vannil. Lahus muutus tagasi sinakaks.
Järeldus: lahus kaotas kuumutamisel värvuse, kuna tärklise ja joodi kompleks lagunes . Kuna tegu on pöörduva reaktsiooniga, siis jahutamisel sinakas värvus taastus.
Kartulitärklis Maisitärklis
Kartulitärklise terad olid veidi ovaalse kujuga. Kartulitärklise terad olid suuremad kui maisitärklisel ning kartulitärklise terade vahel on suurem vahemaa kui maisitärklise pisikeste ringikujuliste terade vahel.