Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Mikk Mosona
YAGB 123988
Juhendaja : Tiina Randla
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Teooria
Invertaas on ensüüm (süstemaatilise nimega b-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas), mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib b-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Kõige levinum b-D-fruktofuranosiid on looduses sahharoos, mille hüdrolüüsiproduktideks on b-D-fruktoos ja b-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallituseened, paljud taimed, aga ka mesilased . Inimesel on invertaas vajalik seedeensüüm.
Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid . Antud töös kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi (valmistatakse kõrge
konsentratsiooniga lahuses, võttes üks ühele hulga
ja triloon-B). Antud reaktiiv täidab kahte rolli:

• Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile mille pH 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni.
  
• Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi.
  

Taandavaid suhkruid sisaldav reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades kindlakonsentratsioonilist 0,02M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon-B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus.
Töö käik
Tegin oma vedela invertaasi preparaadist 40 kordse lahjenduse. 10 ml lahuse kohta 0,25ml invertaasi. Kasutasin automaatpipetti 250 mõõduga, millega viisin mõõdetud invertaasi gradueeritud katseklaasi ja lisasin 10ml märgini puhverlahust. Loksutasin ühtlase konsentratsiooni saamiseks.
Lisasin 50ml-sse katseklaasi 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8.
Katseklaasile panin peale korgi ning asetasin vesitermostaati 30 juurde soojenema.
Panin valmis kolm 250ml koonilist kolbi, igaühesse lisasin pipetiga 10 ml komplekslahust.
Substraadi soojenemisel 30-ni lisasin sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust.
Lahuse loksutasin läbi ja pipeteerisin kiiresti 1ml lahust ühte kolbidest(0-proov).
Substraadi panin tagasi vesitermostaati.
10 minutit hiljem peale ensüümireaktsiooni algust lisasin 1 ml lahust teise kolbi (I-proov).
20 minutit hiljem peale ensüümireaktsiooni algust lisasin 1ml lahust kolmandasse kolbi (II-proov).
Kolvid , mis sisaldavad komplekslahust ja erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, panin püstjahutite alla elektripliidile 10 minutiks keema .
Pärast keetmise lõpetamist, lisasin igasse kolvi 150 ml destilleeritud vett (läbi püstjahuti).
Jahutasin kolvid kraanivee alltoatemperatuurini.
Lisasin kolbidesse 0,2 ml mureksiidi vesilahust, mis andis lahusele sinaka-violetse tooni.
Tiitrisin kovis olevaid lahuseid
(0,02M) lahusega kuni värvus muutus rohekaks.
Kalibrimisgraafiku abil leidsin taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1ml-s reaktsioonisegust võetud proovis.
0-proov
2 ml
1,8 mg/mL
I-proov
13,8 ml
12,3 mg/mL
II-proov
26,3 ml
26,3 mg/mL
Arvutan invertaasi preparaadi aktiivsuse A
valemi järgi:
- taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
– taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
– reaktsioonisegu üldmaht, ml
- tegur üleminekuks mikrogrammidele
- lahjendusmäär
– hüdrolüüsi kestus
– glükoosi molekulmass
– ensüümi töölahuse maht, ml
– ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
Järeldus:
Invertaasi preparaadi aktiivsused on peaaegu võrdsed, seega katse õnnestus.